宫红梅
【摘要】本文综述了高效毛细管电泳的分离原理及模式，蛋白质的分离特性及抑制吸附的方法，电渗流的影响因素和控制方法。
【关键词】高效毛细管电泳;蛋白质;电渗流
1.背景
毛细管电泳法由于其特有的快速，高效，简单，成本低等特点也越来越多的应用于蛋白质的研究中，如多肽的分析，蛋白质的细微结构差异分析，以及鉴定蛋白质的纯度，蛋白质反应动力学过程，测定蛋白质的分子量等[1]。
2.毛细管电泳在蛋白分离中的应用
2.1 高效毛细管电泳用于蛋白质分离的模式
（1）毛细管区带电泳：HPCE中最简单的、应用最广泛的一种方式，毛细管内只充入缓冲溶液，分离过程中电渗流由毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动起着主导作用。一组化合物中，阳离子迁移最快，中性物质居中，而阴离子速度最慢。被分析物中各化合物带电荷数差别越大，相对分子质量的差别越大，分离度越大，但所有的中性物质彼此不能分离。
（2）胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）：结合了电泳技术与色谱技术，也是HPCE中应用最广的方式之一。MECC是唯一的既能分离中性组分又能分离带电组分的电泳技术。其原理是在缓冲溶液中加入表面活性剂，如果表面活性剂的浓度达到临界浓度，则表面活性剂单体就结合在一起形成胶束。在缓冲液中添加的表面活性剂具有吸附、增溶、形成胶束等功能，因此增加了该模式分离化合物的范围[2]。
（3）毛细管凝胶电泳（GCE）：毛细管内填充凝胶或其他筛分介质，荷质比相同但大小不同的分子，在电场力的推动下经凝胶聚合物构成的网状介质中电泳受到的阻力不同达到分离。鉴于凝胶的一些缺点，最近有高分子聚合物代替凝胶，在毛细管中形成动态的网状结构，溶质在网格中发生相对移动，从而依靠分子大小进行分离，即无胶筛分毛细管电泳（NGSCE）。
（4）毛细管等电聚焦（CIEF）：当两性物质在毛细管中形成pH梯度时，不同等电点的物质在外电场作用下向等电点的pH值范围迁移，当溶质迁移到等于其等电点范围时，就不再移动，形成一个窄的溶质带，使具有不同等电点的蛋白质可以分离。
2.2 蛋白质的化学性质及对分离的影响
蛋白质是由氨基酸通过酰胺键连接而成的高分子，氨基酸属两性分子，并有碱性、中性、酸性之分。对应的蛋白质也是两性物质，亦有碱性、中性和酸性之分。蛋白质因其折迭方式、空间结构和修饰基因等的不同，还有亲水或疏水之分。两性物质所带净电荷为零时的pH值称等电点pI。当所处环境大于等电点时，两性物质带负电荷;当所处环境小于等电点时，两性物质带正电荷。在CZE分离蛋白质混合物时，由于蛋白质所带的电荷种类和密度不同达到分离[3]。但是，毛细管的表面硅羟基解离，带负电荷，在分离的蛋白质的等电点大于电泳缓冲液的pH值时，会产生静电吸附，除了硅醇负离子，融硅表面还会产生各种活性位点，如惰性硅氧桥和氢键位点，这些活性位点都会参与蛋白质的氢键和疏水区与管内壁的作用，因此很容易出现吸附问题，尤其是对碱性蛋白质。此外，由于毛细管内壁的不均一性，容易对蛋白质产生物理吸附，当分析物浓度在0.1-1.0mg/ml时，影响非常严重。不管是物理吸附还是化学吸附，都会导致峰拖尾，展宽，使分离效率下降，分离时间延長，重现性差，甚至电渗流消失，严重影响分离。因此，吸附问题是分离过程中要首要解决的[4]。
2.3 常用的解决吸附问题的方法
（1）采用极端pH值（pH8～11或pH<2）的缓冲溶液。Righetti等在pH值2.0-2.5时，为了克服高电导而不能加高电压地缺点，提出了一种采用等电缓冲液的办法，实现了仅一个中性氨基酸不同的两条球蛋白链基线分离[5]。
（2）采用无机和有机添加剂的方法，缓冲液中含有高浓度的中性盐，有机添加剂如二胺类、两性电解质等都能竞争吸附位点，从而有效地抑制蛋白质的吸附。
（3）样品处理：典型方法是用表面活性剂SDS，SDS结合变性的蛋白，消除了蛋白质本身的电荷量影响，使蛋白质依靠分子量大小得以分离。
（4）对毛细管内壁进行改性：主要是指采用物理涂敷或化学键合以及交联等方法，在毛细管壁形成单分子层或交联的涂层。通过涂层来阻止蛋白质与毛细管壁的相互作用，以达到减小蛋白质吸附的目的。由于涂层改变了毛细管壁的状态，因而也会引起电渗流的变化。电中性的涂层会抑制电渗流，若是带正电的高分子涂层则会使电渗流减小甚至反转[6]。
（5）针对不同的被分析物，还有其他的抑制吸附的方法。任吉存，邓延倬等在缓冲液中添加赖氨酸和精氨酸，它们在中性或微碱性的缓冲液里带正电荷，能和带负电的管壁静电吸引结合，抑制了硅醇的解离，使相对迁移时间和相对峰高的重现性增强[7]。
毛细管电泳研究中，探索新的分离介质和新的分离模式可以提高分离效率和毛细管电泳的适用范围[8，9]，这方面的研究工作一直在进展中。
3.结束语
毛细管电泳分离蛋白质具有其高效，快速，样品量少，溶剂量少等特点，但对于实际蛋白质研究还存在一些问题，如吸附问题，分辨率问题，复杂组分的干扰等。各种新的分离模式和探索正在进行中。
参考文献
[1]李林，吴家睿.蛋白质组学的产生及其重要意义[J].生命科学，1999，11（2）：49-50.
[2]孔毅，吴如金.高效毛细管电泳及其在蛋白质、多肽分析中的应用[J].药学进展[J].2000，24（4）：204-208.
[3]屠红旻，夏其昌.毛细管电泳及其在生命科学中的应用[J].生命的化学，1994，14（6）：36-39.
[4]李敏.高效毛细管电泳中的电渗流及控制[J].淮北煤师院学报，2000，21（2）：39-42.
[5]张蕊，郭宝林.高效毛细管电泳技术用于生物碱的分析[J].中草药2005，36（2）：1889-1892.
[6]S.P.Radko.CapillaryElectrophoresis.Proteins.AcademicPress.2000：4009-4014.
[7]Righetti P G，Bossi A，Olivieri E，Gelfi C.J.Biochem.Biophys.Methods，1999.
[8]康经武，陆豪杰.毛细管电泳涂层柱技术的进展[J].色谱，1998，16（1）：26-29.
[9]刘玉，顾峻领.聚合物涂层毛细管柱分离蛋白质的研究[J].北京理工大学学报，1995，4（2）：155-163.
