石胜华 柳惠卿 云晓鹏 张键 赵君 闫洁
摘要：向日葵列當是一种寄生在向日葵根部的寄生性种子植物。向日葵被列当寄生后表现为植株矮化、花盘减小、产量急剧下降，含油量和蛋白含量也明显降低，严重时可导致向日葵绝收。利用12份在田间条件下鉴定出抗性水平的向日葵品种对室内建立的列当寄生体系（培养皿滤纸体系）鉴定结果的准确性进行了评价。在此基础上对供试的80份不同向日葵品种的抗列当水平进行了室内鉴定。结果表明，供试的47份食葵品种中以TP3313为代表的3份品种表现为免疫水平，所占比例为6%;而以JK601为代表的11份品种呈现高抗水平，占比为24%;其余品种均呈现感病和高感水平。供试的33份油葵品种中以F917为代表的11份品种表现为免疫水平，所占比例为33%;而以赤CY102为代表的14份品种呈现高抗水平，占比为43%;感病和高感水平品种占比为3%。整体看来，油葵品种对列当的抗性水平显著高于食葵品种。
关键词：向日葵;列当;品种抗性鉴定;抗性鉴定标准
中图分类号：S565.5;S451文献标志码：A文章编号：1003-935X（2019）02-0028-07
Accuracy evaluation of Appraisal System for Indoor Resistance
Level of Sunflower against Broomrape and Resistance Identification of
Different Sunflower Varieties against Broomrape
SHI Shenghua1，LIU Huiqin1，YUN Xiaopeng2，ZHANG Jian1，ZHAO Jun1，YAN Jie3
（1.College of Agriculture ，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019 China;
2. Plant Protection Institute，Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031，China;
3. College of Grassland，Resources and Environment，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019 China）
收稿日期：2018-12-19
基金项目：国家特有油料产业技术体系建设专项（编号：CARS-14）;内蒙古自治区科技计划“向日葵列当抗性种质资源创新及关键防控技术研究与集成示范”;内蒙古自治区科技计划“向日葵黄萎病抗性种质资源创新及新品种选育”;内蒙古自治区科技重大专项“向日葵高产高效综合技术与产业化”。
作者简介：石胜华（1992—），女，内蒙古巴彦淖尔人，硕士研究生，主要从事向日葵列当研究。E-mail：1032064290@qq.com。
通信作者：赵 君，教授，从事分子植物病理学研究，E-mail：zhaojun02@hotmail.com;闫 洁，高级实验师，从事植物学植物分类研究，E-mail：13634717552@163.com。
Abstract：Sunflower broomrape parasitizes the roots of sunflowers causing dwarfness，loss of yield，and dramatic reductions of oil and protein content. In this study，the resistance level of 12 sunflower varieties was assessed by counting parasite tubercles in a standard Petri dish filter paper system. Results were consistent with those obtained in previous field studies，indicating that the petri dish bioassay could be regarded as a comprehensive evaluating system for sunflower resistance identification.
Eighty sunflower varieties were tested for broomrape resistance. Three varieties represented by TP3313 in the 47 edible sunflower varieties tested were inmune，accounting for 6%; while 11 varieties represented by JK601 were highly resistant （accounting for 24%）; the rest of the varieties were susceptible or high susceptible. Among the 33 oil sunflower varieties tested，11 （33%） varieties represented by F917 were immune while 14 varieties represented by red CY102 （43%） were highly resistant. The proportion of susceptible and highly-sensitivity varieties was 3%. Overall，the resistance of the oil sunflower varieties to the Leydang was significantly higher than that of the sunflower varieties.
Key words：sunflower;broomrape;resistance identification of sunflowers;resistance identification criterion
向日葵列当属于全寄生、根寄生的寄生性种子植物，其生长所需的全部水分和營养物质均须要从寄主的根部吸收[1]。向日葵被列当寄生后，植株生长缓慢，矮化、黄化、萎蔫或枯死，从而造成产量和品质降低，严重时可导致农作物绝收[2]。
列当属植物首次于1951年在塞尔维亚被发现，随后在罗马尼亚、保加利亚、土耳其、西班牙、俄罗斯等国家都相继报道了新的列当属植物的出现[3-5]。我国自1959 年在黑龙江省肇州县发现向日葵列当以来[6]，随着向日葵大面积的连作、引种的混乱、管理粗放，导致列当在全国各向日葵种植地的发生和危害呈逐年加重的态势。向日葵列当在田间发生危害较轻的1株向日葵上平均寄生12株列当，寄生率为46%;危害较重的能够寄生 30～50株，最多高达143株，寄生率为81%[1，7]。2006 年列当在巴彦淖尔市的向日葵地块中仅零星发生，而到2014年该市40%向日葵地块都有列当的发生，平均寄生率为70%以上，造成向日葵产量损失25%～40%。因此，向日葵列当是继向日葵菌核病之后又一限制我国向日葵产业发展的主要因素[6]。
目前，国际上采用的防控向日葵列当的措施主要有种植免疫或高抗列当的向日葵品种、种植诱捕植物、利用生防菌剂进行土壤处理，以及喷洒除草剂等，其中种植免疫或高抗向日葵品种仍然是最为有效的、绿色的向日葵列当的防控措施。因此，室内条件下建立向日葵抗列当水平的快速鉴定体系，以及利用该体系准确地鉴定向日葵育种材料的抗列当水平将为向日葵抗列当育种奠定坚实的基础[8]。
1 材料和方法
1.1 材料
供试的材料为国家特色油料产业体系向日葵育种岗位和试验站提供的向日葵品种、品系或育种材料（以下都简称为材料），共计80份，其中食葵47份、油葵33份，供试材料的相关信息见表1。供试的向日葵列当的种子采自巴彦淖尔市乌拉特前旗西小召镇进行田间向日葵列当水平鉴定的地块，生理小种鉴定为G小种。
1.2 试验方法
1.2.1 田间试验方法
1.2.1.1 田间设计 试验采用随机区组设计设置，每个品种的小区面积为13 m2，每个品种设置3次重复，试验组内的材料随机排列。
1.2.1.2 田间管理 将供试的向日葵品种在2017年6月5日进行人工播种，采用大小行种植，大行 100 cm，小行40 cm，株距40 cm，2 200株/667 m2。当向日葵长到V6～V8期（6～8张真叶）进行中耕除草。
1.2.1.3 田间调查 在向日葵成熟期调查试验小区内向日葵的株数以及列当的寄生数量，利用下列的公式计算列当的寄生率、寄生程度[9] 。
寄生率F=（列当寄生的向日葵株数/小区内调查的总株数）×100%;
寄生程度（AD）=小区内寄生列当的总数/小区内向日葵总株数。
1.2.2 向日葵抗列当水平的室内鉴定（培养皿滤纸法）
1.2.2.1 向日葵列当种子的清洁和表面消毒 将田间采集的向日葵列当种子过筛网（直径为0.18 mm）去除杂质后置于1.5 mL离心管中，然后加入1 mL蒸馏水进行振荡清洗。12 000 r/min离心10 min后弃上清液加入1 mL 0.1%次氯酸钠溶液充分振荡后静置5 min，离心（12 000 r/min） 10 min 后弃上清液;然后向离心管沉淀物中加入 1 mL 75%乙醇，振蕩后静置5 min;离心（12 000 r/min） 10 min后弃上清液，然后加入无菌水冲洗3次。将清洗后的列当种子平铺于滤纸上进行干燥，用毛笔收集干燥后的种子置于 1.5 mL 离心管中备用。
1.2.2.2 向日葵种子的催芽 挑取颗粒饱满的向日葵种子放入盛有150 mL 75%乙醇的锥形瓶中，充分振荡后静置5 min;然后将乙醇倒出，加入无菌水振荡冲洗2次，取出消毒后的向日葵种子用于萌发。
将脱脂棉均匀地铺于玻璃皿中（约3 mm厚度），然后用无菌水将脱脂棉润湿。将消毒后的向日葵种子用纱布包裹置于脱脂棉上，然后在培养皿上盖1块湿润的毛巾，将培养皿置于25 ℃恒温培养箱中培养，促进种子萌发。在催芽期间每天向培养皿内浇水1次，以保持脱脂棉和纱布湿润，出芽后的向日葵种子用于后续向日葵根系分泌物的搜集。
1.2.2.3 向日葵根系分泌物收集 将砂石用清水反复冲洗后放入铝盒中进行高温灭菌。将灭菌后的砂石放入250 mL的广口瓶中（约2/3体积），然后将催芽后的向日葵接种于广口瓶中，用脱脂棉固定向日葵根系，每瓶接种5株向日葵，用锡箔纸包裹广口瓶置于25 ℃恒温培养箱培养48 h后收集向日葵根系分泌物。将向日葵根系分泌物分装于50 mL离心管并放入-4 ℃下保存。
1.2.2.4 向日葵列当种子的预处理 在直径 9 cm 的玻璃皿底部铺上灭菌的滤纸，用收集好的向日葵根系分泌物将滤纸润湿后，将经过消毒处理的向日葵列当种子均匀地平铺在滤纸上，用封口膜封好培养皿，置于23～28 ℃黑暗条件下进行预处理，10 d后便可用于接种处理。
1.2.2.5 接种向日葵列当种子 将脱脂棉均匀地平铺于12 cm×12 cm的塑料培养皿底部（厚约3 mm），脱脂棉上方覆盖1层与培养皿等大的滤纸。然后将1 mg经过预处理后的列当种子均匀地置于滤纸的1/3～2/3处，然后用蒸馏水将脱脂棉与滤纸润湿。将事先催芽的向日葵幼苗接种到培养皿（2株/皿）中，幼苗的根系置于润湿的滤纸上，并且用少量的湿润的脱脂棉固定向日葵的根系。盖上皿盖后用锡箔纸包裹培养皿（对向日葵根系进行避光处理），将培养皿直立竖放到光照培养箱中（白天25 ℃，光照度66%;夜晚18 ℃，黑暗;相对湿度为50%）。每隔1 d向皿内加蒸馏水1次，1周后可进行观察。
1.2.2.6 向日葵列当种子萌发率、寄生瘤结数及出茎数的观察和统计 接种1周后在体视显微镜下观察向日葵列当种子的萌发情况，随机选择100粒向日葵列当种子进行观察，分别统计接种 7 d 后列当种子的萌发率和在接种30 d后寄生的瘤结数。
1.2.2.7 田间条件和培养皿滤纸体系下向日葵抗列当水平的鉴定标准 鉴定标准分别见表2和表3。
2 结果与分析
2.1 向日葵品种抗列当水平的田间鉴定
田间向日葵抗性的结果（表4）表明，12份向日葵品种被划分为5个抗性等级。其中，免疫列当品种有1份，即TP3313;高抗列当品种有3份，包括JK601、JK103、巴葵138;中抗列当品种有2份，为科阳1号、科阳7号;中感列当品种有5份，以JK108、甘葵2号等为代表;高感列当品种有1份，即LD5009。
2.2 评价室内培养皿滤纸体系鉴定向日葵抗列当水平的准确性
室内条件下，利用培养皿滤纸体系对12份田间鉴定出抗性水平的向日葵品种根系寄生的瘤节数进行统计，结果（表5）发现，在田间条件下呈现免疫的品种TP3313，在培养皿体系中寄生瘤结数为0，为免疫品种;而田间表现为高抗列当的品种如JK601、JK103、巴葵138等品种在室内体系中寄生的瘤节数均介于1～5个之间，按照培养皿滤纸体系鉴定标准也鉴定为高抗品种;而田间呈现中抗水平的品种如科阳1号、科阳7号等每皿寄生的瘤节数介于6～10个之间，表现为中抗水平。田间呈现中感的品种如甘葵2号、T33 等每皿寄生的瘤节数介于11～15个之间，呈现出感病水平;而田间呈现高感列当的向日葵品种LD5009每皿寄生瘤节数高于15个，也表现为高感。只有JK105和JK108在田间表型为中感，但在实验室体系下表现为中抗水平（图2）。基于上述田间和室内条件下抗性鉴定的比较结果，笔者认为可以利用培养皿滤纸体系来评价不同向日葵品种的抗列当水平。
2.3 室内条件下评价不同向日葵品种的抗列当水平的鉴定
2.3.1 食葵品种室内抗列当水平的鉴定 利用室内培养皿滤纸体系对47份食葵品种列当种子的萌芽率、瘤节数进行统计，结果如图1所示。列当种子在供试的47份品种根系附近的萌发率介于52%～82%之间，品种间存在显著差异，然而列当种子的萌发率和向日葵的抗性水平没有显著的相关性，如免疫品种TP3313的列当种子萌芽率为74%，而感列当品种LD5009的列当种子萌芽率为71%，抗列当品种LX961的列当种子萌芽率为82%。通过统计根部寄生的列当瘤节数发现，不同品种间存在显著的差异。利用室内培养皿滤纸体系抗性鉴定标准，将没有瘤节寄生的TP3313、同辉15号、同辉31号鉴定为免疫列当的品种;而JK103、S05-2AX、JK601、JK109、巴葵138等11份品种寄生的瘤节数介1～5个之间，鉴定为高抗水平;鉴定为中抗列当的品种共有15份，包括JK105、LSK17、科阳1号、科阳7号等;易感列当的品种有11份，包括赤葵6003、甘葵2号、科阳4号等;鉴定为高感列当的向日葵品种有7份，以宁食葵1号、LD5009、LX336等为代表 （图1）。
2.3.2 油葵品种室内抗列当水平的鉴定 供试的33份油葵品种的列当种子萌发率和瘤节数的统计结果如图2所示。和食葵品种一样，列当种子在油葵品种根系附近的萌芽率介于53%～85%之间，品种之间存在显著差异，但和品种的抗性水平没有显著的相关性，如免疫品种F917的列当种子萌芽率为77%，感列当品种vt11的列当种子萌芽率为72%，抗列当品种矮大头的列当种子萌芽率为72%。同样，按照室内列当抗性评价的标准，将法国1、F917、赤CY106等11份品种鉴定为免疫;将赤CY102、S67、新葵杂5号等14份品种鉴定为高抗水平;而呈现中抗列当水平的品种有7份，以F53、赤KY11-52、赤CY101等为代表;易感列当的品种只有1份，即vt11，寄生瘤节数为13个;没有鉴定出高感列当的品种。
2.3.3 向日葵食葵和油葵品种抗列当水平的比较 对油葵品种和食葵品种的抗列当水平进行比较，结果（图3）表明，14个免疫列当品种中，油葵品种为11个，食葵品种仅有3个;25个高抗列当品种中油葵品种占14个，食葵品种有11个;22个中抗列当品种，油葵品种占7个，15个为食葵品种12个易感列当品种，油葵品种只有1个;7个高感列当品种都为食葵品种。整体看来，油葵品种对列当的抗性水平高于食葵品种。
3 结论与讨论
本研究将田间试验已经鉴定出抗性水平的12个向日葵品种作为材料，对笔者所在课题组建立的室内培养皿滤纸体系的抗性鑒定水平的准确性进行评价，结果表明，在室内培养皿滤纸体系下，供试的12份品种中仅有2份品种抗性水平和田间鉴定水平有一定的出入，其余10份品种在室内条件下鉴定出的抗列当水平和田间鉴定的结果完全一致，表明利用室内体系能够准确且快速地鉴定向日葵的抗列当水平。这是国内外首次利用培养皿滤纸体系对向日葵品种的抗列当水平进行评价。
利用培养皿滤纸体系进行抗性评价过程中，在显微镜下同时观察列当种子在不同向日葵品种根系附近的萌发率，结果表明，列当种子的萌芽率和向日葵品种的抗列当水平没有显著的相关性，表明不同抗性水平的向日葵品种对列当种子萌发率没有影响。然而，利用列当在向日葵根系寄生的瘤节数能够准确地评价向日葵的抗列当水平，这一结果和石必显等的室内鉴定方法[10]相一致。因此，在今后抗列当育种过程中建议利用列寄生的瘤节数而不是列当种子的萌发率来评价向日葵育种材料的抗列当水平。
利用笔者所在实验室建立的室内培养皿滤纸体系对向日葵抗列当水平进行评价，共筛选出免疫列当品种14个，高抗列当品种25个。在免疫和高抗列当品种中，油葵品种所占的比例为64%，远远高出食葵品种。这一结果与王文军等田间鉴定出的向日葵抗列当水平的结果[10-11]高度一致，即列当抗源普遍存在于油葵材料中，食葵材料中抗列当的基因相对较少。同时，石必显的田间抗性鉴定结果也表明，油葵品种的抗性比食葵高[12]，和本研究室内鉴定出的结果有一定的一致性。王鹏东等在筛选向日葵抗列当育种资源时发现，食葵普遍表现出高感列当水平的结果[9，13-14]也和本研究的结果相一致。上述的鉴定结果将为后续在向日葵生产中合理布局不同抗性水平的抗列当品种以及向日葵抗列当育种具有非常重要的指导意义。
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