李祖任 柏连阳
摘要：随着多组学技术的发展，蛋白质组学和代谢组学在杂草领域中的应用已是国内外研究热点。简述蛋白质组学和代谢组学的基本概念;概述蛋白质组学和代谢组学技术研究现状;介绍多组学联合分析的研究策略;论述蛋白质组学和代谢组学在杂草学领域的研究价值及研究现状;并探讨了目前研究中存在的问题及今后研究的主要方向。旨在为今后蛋白质组学和代谢组学在杂草领域的研究提供参考。
关键词：蛋白质组学;代谢组学;多组学联合分析;杂草科学
中图分类号：S451 文献标志码：A 文章编号：1003-935X（2020）01-0001-06
Abstract：With the development of multi-omics technology，application of proteomics and metabonomics in weed science has become an attractive research topic at home and abroad. Proteomics and metabonomics are reviewed，including their basic conception，technological development，and multi-omics analysis. The value and status of proteomics and metabonomics in weed science are expounded，and the current problems and future direction are explored.
Key words：proteomics;metabonomics;multi-omics analysis;weed science
1 蛋白质组和代谢组学简述
蛋白质组（proteome）是在不同时空条件下由生物体基因组、细胞或组织表达的所有蛋白质[1]。蛋白质组学（proteomics）是在各种不同环境条件下生物体基因组、细胞或组织表达全部蛋白质互作机制及其功能的学科[2]。基因组是稳定的，并在同一生物体的所有体细胞中是相同的。与基因组不同，蛋白质组则是多样性的，也就是说作为一个有机整体，在特定条件下同一生物体的蛋白质组与基因组不一定一一对应[3]。因此，只有对生物体内所有蛋白质，即蛋白质组学进行研究，才能更加精准、完整地发现生物与环境互作等生命活动的深层次机制，并利用其内在规律。目前大多数学者将蛋白质组研究内容归结为以下3个方面：（1）大量鉴定生物体内蛋白质特性及翻译后修饰的变化;（2）通过比较蛋白组学技术研究在蛋白质水平上的表达差异，这对于大多数科学研究具有巨大潜力;（3）研究细胞内蛋白质的互作机制，建立功能连锁图[4]。
代谢组（metabolome）是在各种生理条件下生物体或细胞所产生的全部代谢物（metabolite）[5]。曾经科学界对代谢组学定义存在2种不同观点：一种是在20世纪90年代英国帝国理工学院的Nicholson等将“定量测定各种生理刺激或遗传改造所导致生命体的多指标代谢动态响应”定义为代谢组学（metabonomics）;另一种是2l世纪初美国加州大学戴维斯分校的Fiehn提出“生物体系中全部代谢物进行全面、定量的分析”是代谢组学（metabolomics）[6]。目前代谢组学（metabolomics或metabonomics）通常被定义为在某一生理期内定性和定量分析生物或细胞全部低分子量（<1 ku）代谢产物，以便从整体上反映植物代谢物的变化及其调控，为解析植物生长发育及其与环境因子的互作奠定基础[7]。
2 蛋白质组和代谢组学的研究技术简介
2.1 蛋白质组研究技术
蛋白质组学研究需要一套完整的技术体系，其中蛋白质分离技术和鉴定技术是最为关键的技术之一。
蛋白质分离技术主要是电泳，其中应用最广泛的是双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，简称2DE）和高效液相色谱。20世纪70年代中叶报道的双向凝胶电泳是最经典和最成熟的蛋白质组分离技术[8]。双向电泳采用2次凝胶电泳，利用不同蛋白质的带电性和分子量大小的物理化学性质差异的特性从而达到分离各种不同蛋白质的目的[9]。双向电泳技术的流程为蛋白质样品制备——干胶条水合——等电聚焦——聚焦后胶条平衡——十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳——凝胶染色——图像扫描[10]。样品制备是双向电泳的第一步，是关系到双向电泳成败的首要因素。大多数样品制备时，应避免细胞死亡而导致蛋白质降解，并尽快将材料储存于液氮中。将样品在液氮中彻底研磨成细粉，并迅速加入热蛋白沉淀剂，充分摇匀后，将其沉淀并在低温下离心[11]。2DE具有成本低、重复性高的优点，但是缺点也明显，即只能分析可溶性蛋白，工作量大，需要较大量的蛋白样品等，可能是因为细胞或组织中蛋白质含量分布不均，也许会造成一个染色点上含有多种蛋白的状况[12]。高效液相色譜是根据固液相之间的分子尺寸、等电点、亲水性、电荷等特性不同，以高压输液泵为动力装置，将流动相和样品的混合液带入填充固定相的色谱柱，从而达到一种从混合物样品溶液中分离蛋白质的技术[13]。首先根据蛋白质大小通过排阻色谱（正相柱）分离蛋白质，并将该馏分自动引入反相液相色谱（反相柱）中以获得二维色谱图;其次将分析物转移至96孔板上并自动加至基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）靶标以进行鉴定，这样2个色谱柱串联起来组成二维液相色谱系统[14]。高效液相色谱（HPLC）虽然成本高，但是其灵敏度高，分析速度快，自动化程度高，可分离分子尺寸差异大、低丰度、疏水性蛋白质[15]。
传统的蛋白质鉴定技术如Edman降解法和氨基酸分析已被生物质谱分析技术所取代。生物质谱法首先是通过电离样品分子并根据不同离子间的质荷比（m/z）差异分离和确定样品的分子量，其次是依据蛋白质酶解后的肽质量指纹图谱和肽序列信息，搜索蛋白质或核酸序列文库，该技术具有灵敏度高、分辨率高的优点，是迄今为止蛋白质定性的最佳工具[16]。质谱技术要求使用提纯的样品，曾经一度被认为不适合蛋白质间比较，尤其是蛋白质定量比较，在引入稳定同位素标记分子后得到了有效弥补。质谱技术主要使用肽质量指纹图谱（PMF）和肽片段指纹图谱（PFF）。PMF通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测量，其使用激光照射来电离肽段，然后通过测定离子在电场力作用下的飞行时间（time of flying，简称TOF），来计算其质量电荷比，获得肽段的分子量或序列等信息，最后搜索数据库以鉴定蛋白质[17]。MALDI-TOF-MS法操作简单、灵敏度高，与其他蛋白分离方法兼容，并且蛋白质的质荷比数据充足，已成为蛋白质鉴定的首选。PFF通过串联质谱（Tandem MS，简称MS/MS）法测量，其使用电喷雾质谱法检测由液相分离出的肽段，并打断肽段母离子形成碎片离子，通过质量分析器测量碎片离子的分子量，即得MS/MS质谱图，在分析图谱中不同碎片的质量差时，预测被测肽段的序列，然后在序列信息库中比对和鉴定蛋白质[18]。该技术具有精度高、分析时间短，可同时处理多个样品的优势[19]。
2.2 代谢组研究技术
整个植物界中有超过200 000种代谢物，至今仍没有一种代谢组学技术可实现对有机体中全部代谢产物的定量分析;植物体内的代谢物种类繁多，代谢物定性分析不仅难以完成，而且准确度难以保证[20]。质谱（mass spectrometry，简称MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，简称NMR）、红外光谱、库伦分析、紫外吸收及荧光散射均可用于植物代谢物的检测，其中研究与应用最广的技术是质谱和核磁共振[21]。
20世纪70年代早期，核磁共振技术被应用于生物医学代谢组学研究。核磁共振是一种原子核在吸收射频辐射后产生能级变迁的谱学技术，原理是原子核在核外磁场力的驱动下自旋程度不同[20，22]。NMR用于代谢组研究中，主要使用H谱、C谱和P谱，可高通量测定样品中绝大多数的代谢物，能适应现代研究对代谢组学的技术要求，即通过代谢组学技术定性和定量测定尽可能多的化合物[23]。H-NMR的谱峰不仅可体现样品中各代谢物的氢原子，而且能利用图谱中信号的相对强弱表明其相对含量[20]。因此，NMR方法适用于样品代谢物的定性和定量分析，获得的一维H光谱即是代谢指纹，在模式识别后得出相应且有价值的生物信息，并将其进行生物信息学统计分析，从而获得生物体在生命活动中的代谢途径信息[24]。NMR是现有代谢组学中唯一能用于活体和原位的分析技术，优势是对样品无辐射损伤;定量更簡单、无需预选择试验条件，只需简单的预处理，便可在接近生理条件下获得具有较高信息量的图谱[25]。NMR主要的缺陷是购置成本较高，灵敏度较低，对样品的要求较高[26]。当前为了提高分辨率，植物代谢组的研究一般采用多维核磁共振技术、液相色谱核磁共振联用和结合13C或15N的稳定同位素标记联用技术[27-28]。Griffin等利用灵敏度高的魔角旋转（magic angle spinning，简称MAS）技术，获得了高分辨率、高水平的NMR谱图[29]。
目前应用最广泛、最有效的代谢组学检测技术是气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，简称GC-MS）和液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometr，简称 LC-MS），可检测生物体内糖、糖醇、氨基酸、有机酸、脂肪酸和芳胺，以及大量次级代谢物等数百种化学性质不同的化合物[30]。GC-MS适宜分析小分子、热稳定、易挥发、能气化的化合物，具有较高的分辨率和灵敏度，后期数据分析可借助现成的质谱数据库[31]。利用二级气相色谱与飞行时间质谱联用（GC- GC-TOF-MS）可进行高能量分析，其检测的代谢物范围更广[32]。但是，GC分离代谢物分子量范围较窄，不能分离大分子物质，而且无法分离热不稳定性和不能气化的代谢产物[33]。LC-MS则可分析高极性、相对分子质量大及热稳定性差的化合物[34]。大多数情况下 LC-MS 无需衍生化处理，仅需简便的预处理就可上机检测，特别是分离效率高、速度快和应用较广的高效液相色谱[35]。反相液相色谱（reverse phase liquid chromatography，简称RPLC）一般用来分析非极性和中等极性化合物，亲和相互作用色谱（hydrophilic interaction chromatography，简称HILIC）与固相萃取联用一般用于分析强极性化合物[36]。采用极性硅胶或衍生胶作为HILIC的固定相，而其流动相则采用极性有机溶剂或水溶液，其尤其适于强极性和强亲水性小分子物质的分离[37]。
3 多组学联合分析
随着质谱、核磁共振等技术的日新月异，获取蛋白质组、代谢组等单一高通量组学数据变得更容易、更精确。虽然单一组学分析可以描述在该领域中某一生物学过程或者功能，但是生命活动本质包含了多层次、多水平和多功能的复杂结构体系，这就需要将多层组学数据进行联合分析。多层组学联合分析是指归一化和比较分析不同组学的基础数据，构建不同组间数据的关系网络，基于多组学数据从基因、转录、蛋白和代谢水平分层次多角度深入解析对应的生物过程，从而更准确、更全面、更系统地理解生物体响应外界的生理过程[38]。
对来自蛋白质和代谢组等多层次的组学试验数据进行整合分析的一般技术流程为根据中心法则，先分别计算各种组学结果中的差异表达情况，再利用系统生物学手段推算差异表达分子的生物学功能，进一步采用网络协同调控的逻辑整合分析转录，蛋白和代谢等组学差异分子生物学功能，即无论是哪个组学的差异数据，筛选依据是根据功能而定，它们共同处于同一网络中或上下游关联网络中[39]。通过不同组学结果的联合分析，多组间验证互补，以全方位认识生物体应对的变化大趋势，并进一步提出生物体的分子应答模型，并筛选出显著相关的代谢通路或者蛋白、基因、代谢物，为后续功能验证提供基础[40]。
4 蛋白質组学和代谢组学在杂草科学中的应用
近年来，蛋白质组学技术，尤其是同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术，已应用于杂草领域相关研究[41]。Yang等采用iTRAQ技术，分析研究了多抗性稗草和敏感性稗草叶片的蛋白质组学以及蛋白表达差异，从蛋白水平揭示了除草剂抗性引起生态适合度代价的机制[42]。随着种子储存时间的延长，紫茎泽兰种子的14个蛋白质发生了显著变化，探析了紫茎泽兰种子衰老的分子机理[43]。王振英等用蛋白质学技术分析了经光系统II抑制除草剂莠去津（Atrazine）处理小麦幼苗的叶绿体蛋白质组变化，找到了6个在3个代谢途径中起重要作用的蛋白[44]。Sun等利用iTRAQ技术分析出了咪唑乙烟酸对pgr5拟南芥突变体的光合作用、糖酵解和三羧酸循环（TCA）的破坏程度比较大[45]。Fidel等利用蛋白质组技术比对分析了小飞蓬抗草甘膦和敏感2种生物型蛋白差异，揭示了叶绿体是抗草甘膦小飞蓬的第一个靶标[46]。Li等采用Label-free蛋白质学技术分析了植物源羊脂酸处理小飞蓬叶片的蛋白差异，表明光合蛋白显著响应了植物源羊脂酸的处理[47]。
目前，代谢组学技术已开始逐渐应用于杂草科学，尤其是基于色谱或核磁共振的代谢组学技术。Aranibar等首次将代谢组学技术应用于除草剂作用靶标的自动化检测，并构造了以作用靶标为标准的除草剂分类的人工神经网络模型[48]。Trenkamp等选用4种作用靶标不同除草剂的草铵膦、磺草酮、AE944甲酰胺磺隆呋草磺和草甘膦处理拟南芥，分析GC-TOF/MS得到的与时间相关的代谢物轮廓（谱），可区分代表谷氨酰胺合成酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（4-HPPD）、纤维素生物合成（不明靶标）、乙酰乳酸合成酶（ALS）、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）等除草剂作用靶标[49]。Aliferis等开发出一种与多边分析联用的H-NMR代谢指纹图谱分析法，并用于鉴别天然植物毒素pyrenophorol的作用靶标[50]。徐华东应用NRM代谢组学方法研究了丁草胺的毒性机制，并联合分析组织病理学检查和生化指标，系统地探究了在内源性小分子代谢物水平上丁草胺对金鱼（Carassiusauratus）的4个重要器官（鳃、脑、肝、肾）的毒理机制[51]。Miyagi等采用靶标代谢组技术研究了钝叶酸模（Rumexobtusifolius L.）在不同光照和温度条件下不同器官代谢物的积累情况，发现柠檬酸-异柠檬酸-草酸分流是响应光与黑暗的途径[52]。
5 展望
随着功能基因研究的深入，蛋白质组学和代谢组学已成为系统生物学研究领域至关重要的技术手段。生物体的遗传信息由基因经转录向蛋白质传递，基因功能又由表达产物体现，功能基因组学应用于细胞不同层面上的研究探索，各部分内容紧密相连，环环相扣。目前，蛋白质组学和代谢组学研究在杂草领域有一定的应用，但主要利用组学技术探究差异蛋白或者代谢物，缺乏对差异蛋白或代谢物所在代谢通路的研究，即缺乏功能基因组上的深层次探究。
利用蛋白质组学和代谢组学技术在不同水平和尺度上多层次系统分析杂草的生理功能和作用模式，从全局精确掌握各类杂草在各种逆境下的代谢网络和调控机制，为后续的农田高效除草，创制新型靶标除草剂等研究提供基础。今后蛋白质组学和代谢组学在杂草科学研究的可能研究方向如下：（1）杂草响应各种逆境的内在分子机制;（2）化感物质抑草靶标发现，并以此设计合成新型除草剂;（3）杂草抗药性靶标突变与代谢抗性机制。
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