王子纯 贾音 杨从军
摘要：采用培养皿滤纸法，测定了芦苇提取物对小麦、萝卜、黄瓜、稗草和反枝苋5种受体植物的化感作用。结果表明，在0.08 g/mL浓度时，对除黄瓜外的受体植物种子萌发抑制率为69.2%～75.1%，EC50值分别为0.044、0.046、0.033和0.042 g/mL，对黄瓜种子萌发的抑制作用较差，抑制率为10.6 %。在0.16 mg/L浓度时，对5种受体植物幼苗茎生长的抑制率为69.3%～93.2%，EC50值0.042～0.100 g/mL;对幼苗根生长的抑制率为75.3%～97.7%，EC50值0.024～0.079 g/mL。试验结果丰富了芦苇化感作用范围，从中可能发现新的除草活性化合物。
关键词：芦苇;提取物;化感作用;培养皿滤纸法
中图分类号：S482.4
Abstract：Allelopathic effects of reed （Phragmites australis） extracts were assessed by culture plate filter paper method on 5 plant species，Triticum aestivum，Raphanus sativa，Cucumis sativus，Echinochloa crus-galli，and Amaranthus retroflexus. At the concentration of 0.08 g/mL，seed germination inhibition rates were between 69% and 75% except for C. sativus （at 11%），with EC50 values of 0.044，0.046，0.033 and 0.042 g/mL，respectively. At 0.16 g/mL，stem growth inhibition rates for the five species averaged 69% to 93%，with EC50 values of 0.042 to 0.100 g/mL，and root growth inhibition rates were 75% to 98%，with EC50 s of 0.024 to 0.079 g/mL. The results corroborated the reed allelopathic effects indicating that novel compounds with herbicidal activity may be isolated from it.
Key words：Phragmites australis;extract;allelopathic effect;culture plate filter paper method
芦苇（Phragmites australis），多年生禾草，株高可达3 m，主要通过根茎繁殖，可在世界所有温区生长，特别是北美、欧洲大多数国家，加拿大和澳大利亚部分地区[1]。作为一种普遍存在的湿地植物，芦苇在大部分地区形成稠密的单一群落，被认为是世界上最烈性的入侵植物之一[2]，特别近十几年来，芦苇种群在北美东北部及五大湖区急剧扩张，已对当地生物多样性及生态安全构成严重威胁，它的成功入侵与其强烈的化感作用有紧密关系[3-4]。
芦苇水提取物、腐烂物、根分泌物对种子萌发、幼苗生长，以及其他植物种群建立有强烈的毒性作用[5-8]。刘成等发现芦苇水提液可以通过影响加拿大一枝黄花的光合作用，包括叶绿素含量、叶片气孔开放程度以及植物对光照的响应能力等方面，进而对其生长产生抑制作用[9]。李锋民等从芦苇中分离出的化感物质甲基乙酰乙酸乙酷能抑制蛋白核小球藻和铜绿微囊藻的生长[10]。Bains等报道了芦苇分泌酚醛没食子酸并与根际微生物联合作用进而限制临近植物生长[11]。Rudrappa等认为芦苇根系分泌植物毒素经光降解后对周围环境造成严重毒害[12]。
为进一步探索芦苇的化感作用，本研究选择小麦、萝卜、黄瓜、稗草和反枝苋为受体植物，测定芦苇茎叶乙醇提取物的水萃取相的化感活性，为合理利用芦苇野生植物资源和开发新型生物源除草剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
芦苇（Phragmites australis），采自山东省青岛市城阳区古庙村村头，采样时为盛花期，成片生长。将采集的芦苇茎叶剪成2 cm左右的小段，置于通风阴凉处自然阴干，高速万能粉碎机粉碎，低温保存，备用。
小麦（Triticum aestivum，邯郸6172）、萝卜（Raphanus sativa，大连青）和黄瓜（Cucumis sativus，亨优403）种子，购于山东省青岛市城阳区种子站;稗草（Echinoloa crusgalli）和反枝苋（Amaranthus retroflex）种子，采于青岛农业大学校园。
1.2 方法
1.2.1 芦苇茎叶提取物制备 准確称取芦苇茎叶粉末100 g，置于1 000 mL 具塞三角瓶中，加入5倍量 95%乙醇，将三角瓶置于低温摇床上，150 r/min，24 h;抽滤，旋转蒸发仪减压浓缩滤液得乙醇浸膏;将乙醇浸膏用无菌水捏溶，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇充分萃取后，得萃取水相;将萃取水相减压浓缩到一定量后，用无菌水定量至100 mL，得芦苇当量浓度1 g/mL，低温保存备用。
1.2.2 影响种子萌发试验 将“1.2.1”节所得 1 g/mL 芦苇水萃取相，用无菌水稀释成0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 g/mL等5个处理浓度。取直径9 cm培养皿，铺上双层滤纸，加入 3 mL 稀释液，使滤纸充分湿润，并将滤纸紧贴培养皿底部展平，排除气泡。将籽粒饱满、大小一致的种子均匀摆放在滤纸上，小粒种子每培养皿摆放25粒，大粒种子每培养皿摆放15粒。加等量无菌水作对照，每处理3次重复，于28 ℃恒温培养箱中培养。每天观察发芽情况，并及时补充等量稀释液或无菌水保证滤纸湿润。待对照萌发率较高时统计种子发芽数，计算种子萌发抑制率（种子萌发以胚根突破种皮2 mm左右为标准[13]）。
1.2.3 影响植物生长试验 从催芽露白的种子中挑选籽粒饱满，大小、萌发程度整齐一致的种子供试，方法同种子萌发试验，只是每重复处理10粒种子。一定时间后，测定幼苗的茎长和根长，计算生长抑制率。
1.2.4 毒力效应浓度计算 以种子萌发、茎长和根长的抑制率作为衡量芦苇提取液化感作用的响应指标，采用浓度对数-几率值直线法对抑制率和提取液浓度进行线性回归，计算EC50、EC95。
1.2.4 统计方法 采用IBM SPSS Statistics 20 软件进行数据分析，所有数据以 x±s表示。
2 结果与分析
2.1 芦苇提取物对种子萌发的影响
在供试浓度下，芦苇茎叶提取物对小麦、萝卜、黄瓜、稗草和反枝苋种子的萌发均表现抑制作用，但对黄瓜种子萌发的抑制作用对提取物浓度依赖性小，在0.01 g/mL时的抑制率为4.0%，但浓度提高到0.16 g/mL时的抑制率也仅为14.2%（表1）。
在较高浓度，芦苇茎叶水萃取液对小麦、萝卜、稗草和反枝苋种子的萌发均表现强烈抑制作用。在浓度为0.08 g/mL时，抑制率几乎都在70.0%以上;当浓度为0.16 g/mL时，对4种种子萌发的抑制率分别达94.4%、87.0%、84.4%和89.5%（表1）。
2.2 芦苇提取物对幼苗茎生长的影响
芦苇提取物对萝卜、黄瓜和反枝苋幼苗茎的生长表现低促高抑作用，随浓度增大，抑制作用显著加强。在处理浓度为0.01 g/mL时，对茎生长的促进作用分别为2.6%、2.4%、10.0%;但在处理浓度为0.16 g/mL时，对茎生长的抑制作用分别达83.0%、93.2%、69.3%（表2）。
在浓度为0.01～0.16 g/mL时，芦苇提取物对小麦、稗草幼苗茎的生长均表现抑制作用，并有显著的浓度依赖性，对2种植物幼苗茎生长的抑制率范围分别为11.1%～87.0%、12.6%～75.3%（表2）。
综合来看，在高浓度0.16 g/mL时，对黄瓜茎生长的抑制作用最强，抑制率达93.2%，其次是小麦、萝卜、稗草和反枝苋，抑制率分别为87.0%、83.0%、75.3%和69.3%（表2）。
2.3 芦苇提取物对幼苗根生长的影响
芦苇提取物对小麦、萝卜、黄瓜、稗草幼苗根生长表现强烈抑制作用。在处理浓度为0.01 g/mL时，对根生长的抑制率分别达24.1%、22.5%、20.0%、15.3%;在处理浓度为0.16 g/mL时，对根生长的抑制作用分别达97.7%、95.3%、90.1%、89.6%，抑制作用极显著（表3）。
芦苇提取物对反枝苋幼苗的根生长具有低浓度促进高浓度抑制作用。在处理浓度为 0.01 g/mL 和0.02 g/mL时的促生率分别为7.8%、2.0%;而在0.16 g/mL时的抑制率已达75.3%（表3）。
2.4 芦苇提取物对受体植物的毒力效应
由表4可看出，芦苇提取物对小麦、萝卜、稗草和反枝苋种子萌发的抑制毒力强，EC50值分别仅为0.044、0.046、0.033和0.042 g/mL，对黄瓜种子萌发的抑制毒力相对较差，EC50值为 11.072 g/mL。
但芦苇提取物对5种受体植物幼苗生长均有强的抑制毒力，对茎的EC50值在0.042～0.100 g/mL 之间，对根的EC50值在0.024～0.079 g/mL 之间;对每种植物而言，提取物对根的毒力强于对茎的毒力。
结合EC95可知，毒力作用对提取物浓度变化的敏感度不一。黄瓜种子萌发抑制对浓度变化最不敏感，EC95值高达7 398.225 g/mL;但黄瓜茎生长的抑制对浓度变化最敏感，EC95值仅为 0.170 g/mL，在所有EC95值中最小。总体来看，芦苇提取物除对黄瓜种子萌发抑制作用较弱，对濃度变化不敏感外，对其余4种受体植物根、茎生长和种子萌发都有较强抑制毒力。
3 结论与讨论
近年来关于芦苇化感作用的研究屡见报道，对羊角月牙藻、雷氏衣藻和水华微囊藻等藻类，以及一枝黄花、互花米草、蒲公英、小飞蓬和田菁等高等植物均有不同程度的化感作用[14-16]。
本研究表明，芦苇乙醇提取物的水萃取相有较强化感作用。在浓度为0.08 mg/L时，对除黄瓜外的4种受体植物种子萌发抑制率为69.2%～75.1%。在浓度为0.16 mg/L时，对小麦、萝卜、黄瓜、稗草和反枝苋5种受体植物幼苗茎生长的抑制率为69.3%～93.2%，对幼苗根生长的抑制率为75.3%～97.7%。研究结果进一步丰富了芦苇化感作用范围，证实芦苇是一种强化感植物，从芦苇中追踪分离化感成分，可能发现新的除草活性化合物。
在自然和农业生态系统中，植物叶片及其他地上部分的淋溶物、挥发物、根渗出物以及腐烂分解物等都可释放到环境中产生化感作用[17-18]，对邻近植物的种子萌发、幼苗生长、群体建成具有潜在的抑制效应[19-21]。芦苇资源丰富，在我国及全世界广泛分布，深入研究其化感作用并加以充分利用，可使之成为新的生态友好的杂草管理方式。
参考文献：
[1]Kulmatiski A，Beard K H，Meyerson L A，et al. Nonnative Phragmites australis invasion into Utah wetlands[J]. Western North American Naturalist，2011，70：541-552.
[2]Uddin M N，Caridi D，Robinson R W. Phytotoxic evaluation of Phragmites australis：an investigation of aqueous extracts of diferent organs[J]. Mar Freshw Res，2012，63：777-787.
[3]Rudrappa T，Bonsall J，Gallagher J L，et al. Root-secreted allelochemical in the noxious weed Phragmites australis deploys a reactive oxygen species response and microtubule assembly disruption to execute rhizotoxicity[J]. Journal of Chemical Ecology，2007，33（10）：1898-1918
[4]Bains G，Kumar A S，Rudrappa T，et al. Native plant and microbial contributions to a negative plant-plant interaction[J]. Plant Physiology，2009，151（4）：2145-2151
[5]Kettenring K M，McCormick M K，Baron H M，et al. Mechanisms of Phragmites australis invasion：feedbacks among genetic diversity，nutrients，and sexual reproduction[J]. J Appl Ecol，2011，48：1305-1313.
[6]Uddin M N，Robinson R W，Caridi D. Phytotoxicity induced by Phragmites australis：an assessment of phenotypic and physiological parameters involved in germination process and growth of receptor plant[J]. J Plant Interact，2014，9：338-353
[7]Uddin M N，Robinson R W，Caridi D，et al. Suppression of native Melaleuca ericifolia by the invasive Phragmites australis through allelopathic root exudates[J]. Am J Bot，2014，101：479-487
[8]Uddin M N，Robinson R W，Caridi D，et al. Is phytotoxicity of Phragmites australis residue infuenced by decomposition condition，time and density[J]. Mar Freshw Res，2014，65：505-516
[9]刘 成，吴 明，陈晓德，等. 芦苇水提液对加拿大一枝黄花生长及光合作用的化感效应[J]. 生态学杂志，2014，33（3）：624-630.
[10]李锋民，胡洪营. 芦苇抑藻化感物质的分离及其抑制蛋白核小球藻效果[J]. 环境科学，2004（5）：89-92
[11]Bains G，Kumar A S，Rudrappa T，et al. Native plant and microbial contributions to a negative plant-plant interaction[J]. Plant Physiology，2009，151（4）：2145-2151.
[12]Rudrappa T，Choi Y S，Levia D F，et al. Phragmites australis root secreted phytotoxin undergoes photo-degradation to execute severe phytotoxicity[J]. Plant Signaling and Behavior，2009，4（6）：506-513.
[13]周志紅. 植物化感作用的研究方法及影响因素[J]. 生态科学，1999，18（1）：35-39.
[14]郑 琨，赵福庚，张 茜，等. 盐度变化条件下芦苇对互花米草的化感效应[J]. 应用生态学报，2009，20（8）：1863-1867.
[15]门玉洁，李锋民，胡洪营. 芦苇化感组分对羊角月牙藻和雷氏衣藻生长特性的影响[J]. 湖泊科学，2007，19（4）：473-478.
[16]王志强，王 捷，班剑娇，等. 芦苇水浸提液对水华微囊藻的化感作用研究[J]. 安全与环境学报，2014，14（4）：302-306.
[17]黄云霄，齐 勇，杨晓娜，等. 龙葵提取物对不同作物幼苗的化感效应[J]. 杂草学报，2017，35（2）：40-45.
[18]Kimura F，Sato M，Kato-Noguchi H. Allelopathy of pine litter：delivery of allelopathic substances into forest floor[J]. J Plant Biol，2015，58：61-67.
[19]魏 进，刘 霞，张 静，等. 地桃花提取物对10 种植物的抑制活性[J]. 杂草学报，2018，36（3）：24-28.
[20]Bich T T N，Kato-Noguchi H. Isolation and identifcation of a phytotoxic substance from the emergent macrophyte Centrostachys aquatic[J]. Bot Stud 2014，55：1.
[21]李建波，方 丽，郝 雨，等. 野老鹳草水提取物对大豆、玉米、花生的化感作用[J]. 杂草学报，2018，36（1）：31-36
