田旭飞+曲波
摘要：刺萼龙葵（Solanum rostratum）是危害严重的外来入侵植物，基于种子形态的传统检疫方法有一定的局限性，不依赖于形态学特征的DNA条形码技术是基于DNA序列差异对物种进行鉴定的新方法，是传统形态学鉴定方法的有力补充。以刺萼龙葵及其8种龙葵亚属近缘植物为材料，从GenBank数据库中下载rbcL、matK和内转录间隔区（ITS）序列，进行DNA条形码分析，结果显示ITS鉴定效果优于其他片段，可把刺萼龙葵从其近缘植物中鉴别出来。
关键词：刺萼龙葵；DNA条形码；ITS序列；入侵植物
中图分类号：S41-30文献标志码：A文章编号：1003-935X（2017）01-0030-06
Application of DNA Barcoding in Inspection and Quarantine of
the Invasive Plant Solanum rostratum
TIAN Xufei，QU Bo
（Bioscience and Biotechnology College，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）
Abstract： Solanum rostratum is a seriously harmful invasive plant. The traditional method of identifying S. rostratum is by assessing its seed morphological characteristics，a procedure that cannot be realistically performed by customs officers because of many limitations. DNA barcoding is a technique for characterizing species of organisms using a short DNA sequence from a standard and agreed-upon position in the genome. As a powerful supplement to a conventional identification method，it is not affected by morphological traits of samples. In this study we downloaded rbcL，matK and ITS sequences for S. rostratum and its eight related species in Subg. Solanum from GenBank for DNA barcoding analyses. S. rostratum could be distinguished from its closely relative species with ITS being more effective than the other sequences at identifying the invasive plant.
Key words： Solanum rostratum；DNA barcoding；ITS sequence
收稿日期：2017-01-06
基金项目：辽宁省科学事业公益研究基金（编号：2015003013）
作者简介：田旭飞（1992—），男，贵州德江人，硕士，主要从事入侵生物学研究。
通信作者：曲 波，博士，教授，主要从事入侵生物学与生物多样性保护研究。E-mail：syau_qb@163.com。刺萼龙葵（Solanum rostratum Dunal）是茄科茄属龙葵亚属一年生杂草，别称黄花刺茄，原生于北美洲，现已广泛分布世界各地，被許多国家列为检疫性有害植物[1]。1981年刺萼龙葵首次在辽宁省朝阳县被发现[2]，现已扩散至吉林、山西、新疆、内蒙古、河北和北京等地[3-4]，已被我国列为检疫杂草。刺萼龙葵具有极强的适生性和繁殖能力，种子具有休眠性，能抵抗不良环境，一旦成功入侵，危害巨大，会严重抑制其他植物生长，降低生物多样性[5]。
预防是最好的防治，目前各国都很重视杂草检疫工作，但传统的形态鉴定方法难以满足现在的快速检疫需求，而一些先进的分子技术还未转变成切实可行的实践方法[6-7]。目前对刺萼龙葵的检疫检测主要依据其种子的形态特征，而其种子通常夹杂在粮食、羊毛及交通工具中，与其他植物种子混杂在一起，且运输时会发生磨损，使形态特征丢失，导致与其他很多杂草种子的外观相差不多，鉴定更加困难。
DNA条形码（DNA barcoding）是一种基于DNA序列进行生物物种鉴定的技术，即利用标准化的1个或者几个DNA片段进行序列分析，根据核苷酸序列差异，对物种进行快速和准确鉴定[8]。DNA条形码技术不依赖形态学特征，可作为传统形态学检疫检验的有力补充。一个物种如果能和它亲缘关系最近的物种分开，就能与其他物种分开从而被成功鉴定，外来入侵植物如果能与其同属的近缘物种分开，就能被成功检疫。因此，本研究选择刺萼龙葵及其同亚属的8种近缘植物作为分析对象，以生物条形码联盟（Consortium for the Barcode of Life，简称CBOL）推荐的rbcL和matK的核心条形码片段，以及在国内外条形码研究中得到广泛认可的内转录间隔区（ITS）序列作为研究片段，根据NCBI数据库中已有的刺萼龙葵和龙葵亚属中的近缘种序列，对ITS、rbcL和matK 3种序列进行DNA条形码分析。
1 材料与方法
1.1 DNA序列获取
本研究以刺萼龙葵及龙葵亚属中的龙葵（S.nigrum）、假烟叶树（S.verbascifolium）、旋花茄（S.spirale）、红果龙葵（S.alatum）、珊瑚樱（S.pseudocapsicum）、欧白英（S.dulcamara）、海桐叶白英（S.pittosporifolium）及马铃薯（S.tuberosum）8种近缘种植物作为研究对象，从GenBank数据库中下载相应的rbcL、matK及ITS序列，得到rbcL序列52条，matK序列41条，ITS序列27条，相应登录号见表1。
1.2 序列分析
用Mega 5.1软件计算序列间的K2P（Kimura-2-Parameter distance）距离，获得种间变异、种间最小变异、种内变异、种内最大变异等一系列数据；通过TaxonDNA软件比较序列在种内、种间的变异分布，构建柱状统计图，评估Barcoding Gap；用Mega 5.1软件构建NJ系统树，根据各物种在树中的位置，评估不同候选序列对以上几种植物鉴定的有效性。在NJ系统树中，如果刺萼龙葵及其他物种都自成单系，则鉴定成功。
采用最近距离法（Nearest Distance）考察序列的鉴定成功率，计算待鉴定DNA条形码序列与其他样品序列（含已知的刺萼龙葵DNA序列）间的遗传距离（K2P），如果待鉴定DNA条形码序列与其中刺萼龙葵DNA序列的遗传距离最小，则鉴定成功，反之则失败。
2 结果与分析
2.1 序列分析
经剪切校正后，刺萼龙葵rbcL、matK、ITS序列的长度分别为615、735、632 bp，长度均符合DNA条形码片段要求，且有较多的信息位点数和变异位点数（表2）。根据K2P值分析结果，刺萼龙葵各序列的种间差异大小顺序为ITS>matK+ITS>matK+rbcL>rbcL+ITS>matK>rbcL；種内差异大小顺序为：ITS>matK>matK+ITS>rbcL>rbcL+ITS>matK+rbcL。其中ITS及rbcL+ITS组合片段序列的种内最大变异远远小于种间最小变异，最为理想（表3）。
2.2 BarcodingGap分析
BarcodingGap分析结果表明，ITS种内的遗传距离变异集中在K2P数值（最大0.08）较小的左侧，种间遗传距离变异集中在数值较大的右侧（图1）；rbcL+ITS遗传距离变异集中在K2P数值（最大0.03）较小的左侧，种间遗传距离变异集中在数值（K2P最小值为0.05）较大的右侧（图2），满足DNA条形码的BarcodingGap条件。
2.3 鉴定效果分析
从基于ITS序列所构建的NJ系统发育树（图3）可以看出，刺萼龙葵的ITS序列聚类在一起，其他8种龙葵亚属植物的同种不同个体也以较高的支持率聚在一起，鉴别效果达到100%。rbcL+ITS序列所构建的NJ系统发育树聚类效果稍差。经最近距离法分析，ITS在龙葵亚属中的鉴别效果为100%。
rbcL+ITS序列组合的鉴定效果与单用ITS序列相差不大，但单用ITS序列操作更方便，因此选择ITS序列作为茄科龙葵亚属的DNA条形码。
3 讨论与结论
理想的DNA条形码既要有一定的保守性以便于设计通用引物，又要有足够的变异以区分不同的物种，目前还没有找到这种理想的、通用的植物DNA条形码[9]，因此提出分层次的植物DNA条形码鉴定方法，即以相对保守序列鉴定高级分类层次，如科、属，以变异更快的序列鉴定种[10]。不同植物类群最适的DNA条形码序列可能不同；不同的DNA条形码序列也可能适用于相同的植物类群。
本研究中，ITS序列在龙葵亚属种的种内变异为0.023 1，种间变异为0.142 8，比rbcL和matK及各组合片段的鉴别效果更好。张伟等以茄属的26份样品为研究对象，发现trnS-trnG、ndhF和waxy这3个片段组合能从近缘种中鉴别银毛龙葵（Solanum elaeagnifolium），对茄属植物有较强的分辨力[11]。但trnS-trnG、ndhF和waxy这3个片段需要组合使用，序列长，在其他植物类群中的研究也较少，在实践应用中有一定局的限性。本研究以matK、rbcL和ITS为研究序列，发现ITS 1个序列的鉴别力很好，可作为茄属植物的DNA条形码。ITS序列变异速率较快，在早期的植物分子鉴定中应用很多，因此各数据库中有关ITS的序列很多，目前也是植物DNA条形码研究的热门候选片段之一。朱珣之等利用ITS2对17种入侵植物及其36种近缘植物进行DNA条形码分析，在300份样品中鉴定准确率高达95.5%，种间变异明显大于种内变异[12]。胡志刚以63个菊科药用植物样本为材料，发现ITS序列能正确鉴定到种的成功率为87.3%，有良好的鉴别能力[13]。ITS对冬虫夏草、花椒等也有很好的鉴定效果[14-16]。在更多类群中以ITS序列作为DNA条形码开展研究，若能证明ITS序列的鉴别能力很好，把ITS序列作为核心条形码，可以利用已有的ITS序列数据，在构建
植物DNA条形码数据库时可以节省更多的人力和物力。
matK和rbcL是生物条形码联盟推荐的核心条形码序列，在植物DNA条形码研究中有着重要的意义，但随着研究的深入，科学家发现rbcL和matK由于分子进化速率较慢，在种级水平上，特别是对于那些经历了近期适应辐射或快速进化的属来说，分辨率较低[17-21]，因此适合作为高级分类层次的鉴定，不适合种级水平鉴定，这与本研究结果相符。
致谢：感谢沈阳农业大学冯玉龙教授给本文提出的宝贵建议。
参考文献：
[1] 张少逸，魏守辉，张朝贤，等. 刺萼龙葵种子休眠和萌发特性研究进展[J]. 杂草科学，2011，29（2）：5-9.
[2]关广清，高东昌，李文耀，等. 刺萼龙葵——一种检疫性杂草[J]. 植物检疫，1984（4）：25-28.
[3]刘全儒，贯潞生，车晋滇，等. 北京及河北植物新记录（Ⅲ）[J]. 北京师范大学学报（自然科学版），2005，41（5）：510-512.
[4]车晋滇，刘全儒，胡 彬. 外来入侵杂草刺萼龙葵[J]. 杂草科学，2006（3）：58-60.
[5]王维升，郑红旗，朱殿敏，等. 有害杂草刺萼龙葵的调查[J]. 植物检疫，2005（4）：247-248.
[6]刘好霞. 加强进境粮谷检疫监管的重要性及其对策[J]. 安徽农学通报，2013（20）：104-105.
[7]韩晓敏. 进境粮谷携带杂草的隐忧[J]. 植物检疫，2007（1）：28-30.
[8]Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proc Biol Sci，2003，270 （1512）：313-321.
[9]Hollingsworth P M，Graham S W，Little D P. Choosing and using a plant DNA barcode[J]. PLoS One，2011，6 （5）：e19254.
[10] Newmaster S G，Fazekas A J，Ragupathy S. DNA barcoding in land plants：evaluation of rbcL in a multigene tiered approach[J]. Canadian Journal of Botany，2006，84 （3）：335-341.
[11]张 伟，范晓虹，邵秀玲，等. DNA条形码在检疫性杂草银毛龙葵鉴定中的应用研究[J]. 植物检疫，2013（3）：60-65.
[12]朱珣之，高 婷. 基于ITS2序列的17种外来入侵植物分子鉴定[J]. 草业科学，2014，31 （10）：1900-1907.
[13]胡志刚. 菊科藥用植物DNA条形码及叶绿体基因组研究[D]. 武汉：湖北中医药大学，2012.
[14]侯典云，宋经元，杨 培，等. ITS/ITS2条形码序列在花椒药材鉴定中的应用[J]. 中国药学杂志，2014（7）：534-538.
[15]倪梁红，赵志礼，孟千万，等. ITS和psbA-trnH序列鉴别绿绒蒿属藏药植物[J]. 中草药，2014（4）：541-545.
[16]张文娟，康 帅，魏 锋，等. 基于ITS序列分析鉴别冬虫夏草与古尼虫草[J]. 药物分析杂志，2015（9）：1551-1555.
[17]袁俊杰，马新华，龙 阳，等. 利用DNA条形码对10种苍耳属杂草的鉴定[J]. 杂草学报，2016，34（3）：11-16.
[18]Hoveka L N，Bank M V D，Boatwright J S，et al. The noncoding trnH-psbA spacer，as an effective DNA barcode for aquatic freshwater plants，reveals prohibited invasive species in aquarium trade in South Africa[J]. South African Journal of Botany，2016，105：299-305.
[19]袁俊杰，魏 霜，马新华，等. trnH-psbA序列作为DNA条形码在苍耳属杂草鉴定中的应用[J]. 杂草学报，2016，34（2）：1-6.
[20]Ghahramanzadeh R，Esselink G，Kodde L P，et al. Efficient distinction of invasive aquatic plant species from non-invasive related species using DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Resources，2013，13 （1）：21-31.
[21]任保青，陈之端. 植物DNA条形码技术[J]. 植物学报，2010，45（1）：1-12.
