王大铭 周琳 宋新元
摘要：以我国自主研制的转EPSPS基因抗除草剂玉米CL38-1为试验材料，通过抗除草剂喷施和生存竞争能力评价，研究其对目标除草剂草甘膦的耐受性以及在农田和荒地环境下杂草化的可能性。结果表明，在喷施41%草甘膦异丙胺盐水剂1230g/hm2（推荐剂量）和2460g/hm2（推荐剂量的2倍量）1、2、4周后，对玉米的株高及生长无不良影响，受害率为0。在农田环境下，转基因玉米CL38-1与非转基因对照郑58在生育期、株高、覆盖度、产量等方面无明显差异，在栽培地环境中可正常生长；在荒地条件下，较之杂草没有竞争优势，无杂草化风险。
关键词：转基因玉米；除草剂抗性；生存竞争能力；杂草化；环境安全评价
中图分类号：S451文献标志码：A文章编号：1003-935X（2016）02-0023-06
转基因玉米产业在世界范围内取得重要成功，并在多个国家获批种植或作为食品及饲料[1-3]，1996至2015年全球转基因作物累计种植面积达20亿hm2，其中6亿hm2为转基因玉米[4]。如今，培育多基因、以抗虫抗除草剂性状为代表的复合性状转基因玉米成为重要的发展趋势[5]。
研发与安全评价同步是转基因育种的重要原则，因此，对于转基因玉米的安全性问题，尤其对环境和生态多样性可能带来的潜在风险被广泛关注[6-7]。针对抗逆性状转基因植物，对生态系统是否具有破坏性[8-9]，目标性状是否能满足产业需求以及是否存在杂草化风险等方面是环境安全评价的重点[10-13]。
本试验选址在我国春玉米产区吉林省，选用我国自主研发、具有知识产权的转EPSPS基因抗除草剂玉米CL38-1及其对应的非转基因对照郑58为研究对象。利用田间喷施目标除草剂（草甘膦）试验，以施药1、2、4周后的株高及受害率作为评价指标，评价其除草剂耐受性；利用栽培地与荒地模拟试验，以玉米株高、覆盖度、产量、杂草种类等作为评价指标，评价其生存竞争能力，旨在为转EPSPS基因抗除草剂玉米CL38-1在吉林省未来的产业化推广提供基础参考数据。
1材料与方法
1.1试验材料
转EPSPS基因抗除草剂玉米CL38-1（CL38-1）及其对应的非转基因对照郑58（CK），均由中国农业大学提供。供试除草剂：41%草甘膦异丙胺盐水剂，购于孟山都公司。
1.2试验地点
试验于吉林省农业科学院公主岭院区国家转基因玉米大豆中试与产业化基地（公主岭）环境安全研究试验圃场进行。公主岭市属中温带湿润地区大陆性季风气候；处于124°02′～125°18′E，43°11′～44°09′N，与同纬度的美国玉米带、乌克兰玉米带并称为“世界三大黄金玉米带”。
1.3试验设计
1.3.1除草剂耐受性评价种植方式：参考当地玉米大田生产方式，分区设计，小区面积为24m2（4m×6m），3次重复，区组随机排列。2013年5月15日播種，采用人工播种方式，2～3粒/穴。
处理方式：转基因玉米喷施清水、目标除草剂；对应的非转基因对照郑58喷施清水、目标除草剂。所用除草剂为41%草甘膦异丙胺盐水剂，施用剂量分别为农药登记标签的推荐剂量（1230g/hm2）和推荐剂量2倍量（2460g/hm2）。在玉米植株生长至6叶期喷施除草剂。各小区中间2行为调查行。分别在用药1、2、4周后调查，记录成苗率、植株高度（选取最高的5株）、药害症状（选取药害症状最轻的5株）。药害症状分级按GB/T19780.42《农药田间药效试验准则（一）除草剂防治玉米地杂草》执行。
各小区草甘膦除草剂危害率计算公式：
X=[SX（]∑（N×S）[]T×M[SX）]×100%。
其中：X为草甘膦危害率，%；N为同一危害级别的植株数，株；S为危害级别；T为调查植株总数，株；M为试验观测到的最高危害级别。
1.3.2生存竞争能力评价栽培地：每个小区面积为25m2（5m×5m），3次重复，各小区随机排列，按吉林省常规耕作模式进行管理，玉米常规播种时间为2013年5月15日，采用双粒点播的方式进行播种，株间距25cm。记录玉米主要生育期（包括种植时间、出苗期、抽穗期、吐丝期及成熟期）。在玉米苗期（定苗7d后）、心叶中期（小喇叭口期）、心叶末期（大喇叭口期）、抽雄期以及吐丝期，采用对角线5点取样法，每小区调查10株玉米的株高，并估算覆盖度。在成熟期每小区收获20株玉米果穗，比较转基因玉米与对应的非转基因对照玉米在产量性状方面的差异。
荒地：每个小区面积为6m2（2m×3m），4次重复，各小区随机排列。试验分2批播种，第1批于2013年5月15日播种，第2批于2013年6月10日播种。每次播种均采用地表撒播和深度（5cm）播种2种方式，播种量为每小区150粒种子，播种后不进行任何栽培管理。采用对角线5点取样法，每点调查0.25m2。播前调查1次，播种30d开始至玉米成熟，每月调查1次。调查并记录试验小区内玉米植株的高度与植株垂直投影面积占小区面积的比例，估算出覆盖度，以及杂草种类、数量与覆盖度。
1.4数据分析
采用DPS数据处理系统对调查数据进行方差分析。
2结果分析
2.1除草剂耐受性评价
如表1所示，喷施除草剂1周后，喷施推荐剂量除草剂处理试验区中，转基因玉米生长正常，受害率为0；对应的非转基因对照玉米显示出明显的药害症状，出现植株停止生长、叶片枯萎发黄等症状，受害率达到67%。喷施2倍推荐剂量除草剂试验区，转基因玉米生长正常，受害率为0；对应的非转基因对照玉米显示出明显的药害症状，出现植株停止生长、叶片枯萎发黄等症状，受害率达到75%。在不喷施除草剂、喷施推荐量除草剂、喷施推荐量2倍除草剂等3个处理中，转基因玉米株高稍有不同，但差异较小。对应非转基因玉米在喷施除草剂与未喷施除草剂处理间的株高差异显著。
喷施除草剂2周后，喷施推荐量除草剂处理试验区，转基因玉米生长正常，受害率为0；对应的非转基因对照玉米具有明显的药害症状，大部分植株停止生长，受害率达到92%。喷施2倍推荐剂量除草剂试验区，转基因玉米生长正常，受害率为0；对应的非转基因对照玉米具有明显的药害症状，植株停止生长，受害率达到100%。在不喷施除草剂、喷施推荐量除草剂、喷施推荐量2倍除草剂的3个处理中，转基因玉米株高基本一致，无显著差异。
喷施除草剂4周后，喷施推荐剂量除草剂处理试验区，转基因玉米生长正常，受害率为0；对应的非转基因对照玉米显示出明显的药害症状，植株全部枯萎死亡，受害率达到100%。喷施2倍推荐剂量除草剂试验区，转基因玉米生长正常，受害率为0；对应的非转基因对照玉米植株全部枯萎死亡，受害率达到100%。在不喷施除草剂、喷施推荐量除草剂、喷施推荐量2倍除草剂的3个处理中，转基因玉米株高基本一致，无显著差异。
以上分析表明，对应的非转基因对照玉米对除草剂敏感，无耐受性或耐受性较差。转基因玉米对除草剂具有明显的耐受性，并且不喷除草剂、喷施推荐剂量、喷施2倍推荐剂量除草剂等3个处理对转基因玉米植株的生长发育无明显影响。
2.2生存竞争能力评价
2.2.1栽培地生存竞争能力
2.2.1.1生长期监测如表2所示，转基因玉米及其对应的非转基因对照玉米生育期基本一致，无明显差异。
2.2.1.2株高
栽培地试验中，对转基因抗除草剂玉米CL38-1及其对应的非转基因对照郑58的株高分别在苗期、心叶中期、心叶末期、抽雄期、吐丝期进行5次调查。如表3所示，各调查时期转基因抗除草剂玉米CL38-1及其对应的非转基因对照郑58的株高差异均未达到显著水平。
2.2.1.3栽培地玉米覆盖度
栽培地试验中，对转基因抗除草剂玉米CL38-1及其对应的非转基因对照的覆盖度分别在苗期、心叶中期、心叶末期、抽雄期、吐丝期进行5次調查。如表4所示，仅在苗期，转基因玉米及其对应的非转基因对照在覆盖度上差异显著，其余各个时期，两者覆盖度均不存在显著差异。
2.2.1.4产量性状产量、穗长、穗茎和百粒质量的测定结果如表5所示，转基因玉米与其对应的非转基因对照郑58的调查结果基本相同，无显著差异。
2.2.2荒地生存竞争能力
表面撒播和深度播种各处理小区优势杂草种类一致，优势杂草种类主要有稗草、龙葵、藜、反枝苋、豚草、苘麻、葎草，还有少量苍耳、狗尾草、酸模叶蓼、地肤等。如表6所示，比较转基因玉米及其对应的非转基因对照玉米2个处理的杂草覆盖度，除2013年7月份表面撒播处理外，其余均不存在显著差异。
3结论与讨论
目标性状有效性是应用转基因植物的基础所在，针对抗虫转基因玉米，一般采用田间人工接虫鉴定与室内生测相结合的方法。武奉慈等采用田间人工接虫鉴定方法，根据玉米抗螟性田间鉴定评价标准，研究转基因玉米Bt799和NC6304YGRR对亚洲玉米螟的抗性，研究结果表明，2种转基因玉米对亚洲玉米螟抗性均显著高于各自对应的非转基因对照郑58，均能保护玉米在整个生育期内不受亚洲玉米螟危害[14]。王月琴等采用田间接虫与室内生测相结合的方法研究转基因玉米Bt799对亚洲玉米螟的抗性，室内生测结果表明玉米Bt799对亚洲玉米螟具有较好的毒杀效果，田间接虫结果表明转基因玉米在整个生育期对亚洲玉米螟都有较高的抗性[15]。针对抗除草剂性鉴定，一般采用田间植株喷施目标除草剂的方法。Heck等将双价[WTBX][STBX]CP4-EPSPS[WTBZ][STBZ]转入玉米，通过在玉米植株3叶期和6叶期喷洒164.94g/hm2草甘膦的方法来筛选高抗株系，得到了可抗4倍生产剂量草甘膦的转基因玉米[16]。高秀清等对新培育的抗除草剂（草甘膦）转基因大豆新材料SNT1进行了田间鉴定，研究结果表明，抗草甘膦转基因大豆SNT1在大田条件下能稳定、有效抵抗草甘膦除草剂，且抗草甘膦性状的表达并未影响其他农艺性状[17]。
在生存竞争能力评价研究方面，孙红炜等对抗虫耐除草剂棉花639017、当地棉花冀棉106在2种土壤类型条件下开展生存竞争能力研究，结果表明，外源基因的导入并未增强抗虫耐除草剂棉花的生存竞争能力，因此，抗虫耐除草剂棉花无杂草化风险[18]。宋新元等完成了对抗除草剂玉米CC-2生存竞争能力评价，结果表明在栽培地环境中，转基因玉米CC-2与其对应的非转基因对照郑58在株高、杂草覆盖度和产量等方面均一致，可正常生长；在荒地环境中，转基因玉米CC-2及其对应的非转基因对照郑58与杂草相比不具备竞争优势，无杂草化风险[19]。陈小文等研究转[WTBX][STBX]CRY1AC[WTBZ][STBZ]基因玉米及对应的非转基因对照郑58在野外自然条件及模拟野外条件下的生存能力，结果表明，生存竞争能力从弱到强的顺序为非转基因玉米<转基因玉米<杂草，转基因抗虫玉米虽然在与杂草的竞争中优于非转基因受体，其种子也能越冬，但在试验条件下不会演变成超级杂草[1]。
鉴于目标性状有效性及杂草化风险与拟推广区环境的相关性，本试验选取我国自主研制的转基因抗除草剂玉米CL38-1，在拟推广区吉林省，利用田间喷施目标除草剂方法研究其对草甘膦的耐受性；并综合利用栽培地与荒地模拟试验，评价其生存竞争能力。研究结果表明，喷施除草剂4周后，转基因玉米生长正常，受害率为0，对应的非转基因对照郑58显示出明显的药害症状，植株全部枯萎死亡，受害率达到100%；不喷除草剂、喷施推荐剂量、喷施2倍推荐剂量除草剂等3个处理对转基因玉米CL38-1植株的生长发育无明显影响。可判定转基因玉米CL38-1对除草剂（草甘膦）有明显的耐受性，达到产业应用要求。
在生存竞争能力方面，栽培地和荒地试验结果表明，转基因玉米CL38-1与其对应的非转基因对照玉米品种郑58在生育期、株高、覆盖度、产量等方面无明显差异，在栽培地环境中可正常生长；在荒地条件下，较之杂草没有竞争优势，无杂草化风险。
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