左平春++臧晓霞+陈仕红++纪明山
摘要：为明确稻稗对[XCZ1.tif；%95%95，JZ]唑酰草胺的非靶标抗药性和对氰氟草酯的交互抗药性水平，通过剂量反应试验测定辽宁新民（R1）、黑龙江虎林（R2）和黑龙江哈尔滨（R3）3个稻稗种群对[XCZ1.tif；%95%95，JZ]唑酰草胺的非靶标抗药性和对氰氟草酯的交互抗药性水平。结果显示，R1、R2、R3在喷施细胞色素P450抑制剂杀草强后对[XCZ1.tif；%95%95，JZ]唑酰草胺的抗性指数比分别为1.14、1.71、2.38，表明R1对[XCZ1.tif；%95%95，JZ]唑酰草胺的抗药性与非靶标P450的活性无关，R2和R3对[XCZ1.tif；%95%95，JZ]唑酰草胺的抗药性可能是靶标与非靶标的共同作用。3个稻稗种群对氰氟草酯的抗性指数分别为2573、12.79、10.29，表明3个稻稗种群都对氰氟草酯产生了交互抗药性。
关键词：稻稗；[XCZ1.tif；%95%95，JZ]唑酰草胺；氰氟草酯；P450；交互抗药性
中图分类号：S451文献标志码：A文章编号：1003-935X（2016）04-0028-05[KH+7mmD]
Non-target Resistance to metamifop and Cross-Resistance to [JZ]Cyhalofop-Butyl in Echinochloa phyllopogon （Stapf） Koss.
[KH+7mmD][WT5BZ][JZ（]ZUO Pingchun，ZANG Xiaoxia，CHEN Shihong，JI Mingshan
[WT5”BZ]（College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866）
[JZ）][KH+7mmD][WT5”HZ]Abstract：
[WT5”BZ]Non-target resistance to metamifop and cross-resistance to cyhalofop-butyl in Echinochloa phyllopogon was evaluated dose-response experiments using populations from Xinming in Liaoning Province （R1），Hulin in Heilongjiang Province （R2） and Haerbing in Heilongjiang Province （R3）. The resistance index to metamifop of R1，R2，R3 decreased 1.14，1.71and 2.38 times，respectively after exposure to the cytochrome P450-inhibiting herbicide，amitrole，indicating that resistance of R2 and R3 to metamifop is associated with the activity of P450 enzymes whereas that of R1 is not. The resistance index to cyhalofop-butyl of R1，R2，R3 populations was 25.7，12.8 and 10.3，which indicates that all of the three populations had a cross-resistance to cyhalofop-butyl.
[XCY1.tif]唑酰草胺和氰氟草酯屬于乙酰辅酶A羧化酶（acetyl co-enzyme A carboxylase，简称ACCase）抑制剂，对稻田稗草具有较好的防治效果，是目前水稻田用来防治稗草的常用除草剂[1]。ACCase能够催化生成脂肪酸合成中的一种关键代谢产物——丙二酸单酰辅酶 A，是植物体内脂肪酸合成途径的关键酶。ACCase抑制剂通过抑制 ACCase 的活性从而阻断脂肪酸的合成，最终杀死杂草。由于ACCase类除草剂对非禾本科杂草具有高度的选择性，所以在全球范围内被广泛用来防治禾本科杂草。但是该类除草剂作用靶标位点单一，长期使用极易导致杂草种群抗药性的产生和发展[2-3]。至今，全球已有47种抗此类除草剂的杂草生物型，我国正式报道的有7种[4]。研究表明，杂草对ACCase产生抗药性及机制主要有2种：靶标基因突变和非靶标作用。目前已经报道编码ACCase靶标基因上有8个氨基位点发生突变[5]。
杂草对ACCase抑制剂的抗药性除了与靶标基因有关外，还与非靶标作用有关。非靶标作用包括细胞色素P450代谢作用的提高、膜的效应和对除草作用的屏蔽作用。其中P450代谢作用的增强是最常见的作用方式。P450 是一类以其还原态与一氧化碳结合的含血红素铁硫蛋白，具有很强的活性和亲水性，在植物体内P450可以作为关键酶通过代谢外源化合物参与除草剂的解毒过程。1969年Frear等首次报道了棉花幼苗微粒体中的混合功能氧化酶对灭草隆（monuron）的代谢作用。大量研究表明，植物体内过量表达的细胞色素P450可以提高对除草剂的抗性，并且可以对多种不同作用机制的除草剂产生抗性。P450参与除草剂代谢主要的作用方式主要有脱烷基化作用、环甲基羟基化作用、芳环的羟基化作用、脱硫氧化作用和催化酯键断裂[6-8]。
稻稗[Echinochloa phyllopogon （Stapf） Koss.]属于稗属，是稻田里主要危害的杂草之一，由于其生长习性与水稻相似，是水稻田里很难防治的一种杂草。ACCase类抑制剂在对稻稗的防治中起到了重要作用，但长期大量的使用已经导致稻稗对ACCase类抑制剂产生了抗药性。本研究通过室内盆栽法，测定R1、R2和R3体内细胞色素P450的活性和对氰氟草酯的交互抗药性，以期明确3个稻稗种群对[XCY1.tif]唑酰草胺的非靶标抗药性和对氰氟草酯的交互抗药性水平，为指导科学合理用药和抗ACCase抑制剂类杂草的治理提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试材料
疑似抗性稻稗种子于2015年10月采自辽宁省新民市（R1）、黑龙江省虎林市（R2）和哈尔滨市（R3）；疑似敏感性稻稗种子采自沈阳市东陵公园湖边（S）。种子在阴冷干燥处保存。
药剂：10%[XCY1.tif]唑酰草胺乳油，苏州富美实植物保护剂有限公司；15%氰氟草酯水乳剂，江苏辉丰农化股份有限公司；97%杀草强（amitrole）标准品，德国 Bolling Range（BR）公司；75%赤霉酸结晶粉，上海通瑞生物科技有限公司。
1.2试验方法
将不同种群的稻稗种子用200 mg/L赤霉酸催芽24 h后，将其放于带有2层滤纸的直径为9 cm的培养皿中，然后将培养皿置于27 ℃光照培养箱中催芽3 d后，分别种植于直径 11 cm×高9 cm的塑料花盆内，种植深度 2 cm，然后放置于温室，生长温度条件为白天（25±5） ℃，夜间（14±5） ℃。出苗后人工间苗，每盆保留10株生长一致的植株，待其长到3～5叶期施药。
非靶标抗药性测定。预试验表明，喷施杀草强200 g a.i./hm2对稻稗种群的生长具有轻微的影响，本试验中杀草强的施用浓度为 200 g a.i./hm2。对稻稗种群R1、R2、R3和S喷施杀草强 200 g a.i./hm2 6 h后，对R1、R2和R3稻稗种群喷施[XCY1.tif]唑酰草胺60、120、240、480、960、1 920 g a.i./hm2，對S稻稗种群喷施[XCY1.tif]唑酰草胺375、7.5、15、30、60、120 g a.i./hm2，分别以不施用杀草强的同种[XCY1.tif]唑酰草胺系列浓度处理作对照[9]。
交互抗药性测定：对稻稗种群R1、R2和R3喷[JP3]施氰氟草酯53、106、212、424、848、1 696 g a.i./hm2，[JP]S喷施氰氟草酯3.31、6.62、13.25、26.5、53、106 g a.i./hm2。
以上每个处理设清水对照，每个处理重复3次，施药后21 d，剪去每盆全部地上部分称其鲜质量。
1.3统计分析
整株植物测定按下列公式进行非线性回归分析[10]：
式中：y为特定除草剂用量下所测杂草鲜质量的相对百分比，x为除草剂用量，C为剂量反应下限，D为剂量反应上限，GR50为鲜质量抑制中量，b为斜率。数据用Sigmaplot 12.5处理。
2结果与分析
2.1稻稗对[XCZ43.tif]唑酰草胺的非靶标抗药性
由图1、表1可见，单独喷施200 g a.i./hm2杀草强对稻稗的生长有轻微的影响，但是施用杀草强对敏感性种群S的影响不大。随着[XCY1.tif]唑酰草胺浓度的增大，单独喷施[XCY1.tif]唑酰草胺（图1-a）和喷施[XCY1.tif]唑酰草胺+杀草强（图1-b）2组稻稗种群的相对鲜质量都表现出下降的趋势，种群R2和R3相比不喷施杀草强时下降速率明显变快。S种群对[XCY1.tif]唑酰草胺的GR50为1995 g a.i./hm2，当喷施杀草强后施用相同系列浓度的[XCY1.tif]唑酰草胺时GR50为 21.38 g a.i./hm2；而种群R1、R2和R3在只喷施[XCY1.tif]唑酰草胺时的GR50分别为674.88、599.99和 296.75 g a.i./hm2，抗性指数分别为33.87、30.07和14.87，当喷施[XCY1.tif]唑酰草胺+杀草强后[FK（W1。2]GR50[FK）]分别为634.73、375.05和13363 g a.i./hm2，抗性指数分别为29.69、17.54和6.25，与只喷施[XCY1.tif]唑酰草胺相比抗性指数比分别为1.14、1.71和2.38（表1）。结果表明，R1对[XCY1.tif]唑酰草胺的抗药性与P450的活性关系不大，R2、R3对[XCY1.tif]唑酰草胺的抗药性可能与P450活性的增强有关。
2.2稻稗对氰氟草酯的交互抗药性
按田间推荐剂量喷施氰氟草酯106 g a.i./hm2后，种群S相对鲜质量不足10%，种群R1、R2和R3的相对鲜质量分别为87.66%、7449%和62.95%；随着氰氟草酯浓度的增大，各种群相对鲜质量都表现出下降趋势（图2）。R1、R2和R3 GR50分别为401.08、191.39和160.47 g a.i./hm2，抗性指数分别为25.73、12.79和10.29（表2），3个稻稗种群对氰氟草酯的抗药性排序依次为R1>R2>R3。结果表明，R1、R2和R3都对氰氟草酯产生了交互抗药性，且都为高抗性。
3结论与讨论
险分级的高风险级别，一般连续使用该类除草剂 6～10年，杂草就会产生抗药性[11]。除草剂在防除杂草时除了会导致杂草对靶标位点产生抗药性之外，同时也会给非靶标杂草造成一定的压力，在压力胁迫下杂草通过提升特定的协同防御机制以便在不利的生长条件下生存。现已有大量的证据证明细胞色素P450酶系参与了对多种除草剂的代谢和解毒作用[12]。Yu等在研究硬直黑麦草（Lolium rigidum Gaud.）对ACCase抑制剂的抗药性时认为其抗药性可能是靶标与非靶标的共同作用[13]；毕亚玲在研究日本看麦娘（Alopecurus japonicus Steud.）对精[XCY1.tif]唑禾草灵的抗药性时发现其抗药性也与P450的活性有关[14]。本试验通过室内盆栽法测定了稻稗体内细胞色素P450的活性，发现R2和R3稻稗对[XCY1.tif]唑酰草胺的抗药性不仅与靶标有关，还与细胞色素P450代谢的增强有一定的关系，这也与以上研究结论一致。
杂草的交互抗性是指一种杂草在某种除草剂选择压力的作用下，以相同的抗性机制对2种或多种作用机制相同的除草剂表现抗药性[15]。本试验通过室内盆栽法测定后发现稻稗对在ACCase抑制剂[XCY1.tif]唑酰草胺产生抗药性后对氰氟草酯也产生了抗药性。
因此，为了预防以及控制抗药性杂草的扩散、蔓延，应避免大量频繁使用单一或同一作用机制除草剂。本研究首次明确了稻稗对[XCY1.tif]唑酰草胺的非靶标抗药性以及对氰氟草酯的交互抗药性，为稻田稻稗抗药性的监测与治理工作提供了一定的理论依据。
参考文献：
[1]李永丰，张自常，杨霞，等. 稻田稗属杂草对芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的差异敏感性及其机理[J]. 江苏农业学报，2015，31（3）：543-551.
[2]黄世霞，王庆亚，董立尧，等. 乙酰辅酶 A 羧化酶抑制剂类除草剂与杂草的抗药性[J]. 杂草科学，2003（2）：1-6.
[3]郭峰，张朝贤，黄红娟，等. 杂草对ACCase抑制剂的抗性[J]. 杂草科学，2011，29（3）：1-6.
[4]Heap I. International survey of herbicide resistant weeds：annual report Internet[EB/OL]. [2016-08-25]. http：//www.weedscience.org.
[5]Li L X，Bi Y L，Liu W T，et al. Molecular basis for resistance to fenoxaprop-p-ethyl in American sloughgrass （Beckmannia syzigachne Steud.）[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2013，105（2）：118-121.
[6]胡利鋒，廖晓兰，周小毛，等. 细胞色素P450对除草剂代谢作用的研究进展[J]. 中国农学通报，2011，27（24）：238-243.
[7]吴翠霞，吴小虎，张晓芳，等. 细胞色素P450 酶系对除草剂代谢作用的研究进展[J]. 农药研究与应用，2008，12（6）：8-12.
[8]Frear D S，Swanson H R，Tanaka F S. N-demethylastion of substituted 3-（phenyl）-1-methylureas：isolation and characterization of a microsomal mixed function oxidase from cotton[J]. Phytochemistry，1969（8）：2157-2169.
[9]Pan L，Li J，Zhang T. Cross-resistance patterns to acetyl coenzyme A carboxylase（ACCase） inhibitors associated with different ACCase mutations in Beckmannia syzigachne[J]. Weed Research，2015，55（6）：609-620.
[10]Seefeld S S，Jensen J E，Fuerst E P. Log-logistic analysis of herbicides dose response relationships[J]. Weed Technology，1995，9（2）：218-227.
[11]Devine M D. Mechanisms of resistance to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibitors：a review[J]. Pesticide Science，1997，51（3）：259-264.
[12]Werck-Reichhart D，Hehn A，Didierjean L. Cytochromes P450 for engineering herbicide tolerance[J]. Trends in Plant Science，2000，5（3）：116-123.
[13]Yu Q，Abdallah I，Han H P，et al. Distinct non-target site mechanisms endow resistance to glyphosate，ACCase and ALS-inhibiting herbicides in multiple herbicide-resistant Lolium rigidum[J]. Planta，2009，230（4）：713-723.
[14]毕亚玲. 小麦田日本看麦娘对精[XCZ1.tif]唑禾草灵和甲基二磺隆的抗性研究[D]. 泰安：山东农业大学，2013.
[15]张朝贤，倪汉文，魏守辉，等. 杂草抗药性研究进展[J]. 中国农业科学，2009，42（4）：1274-1289.[HT][HJ][FL）]
