袁俊杰+马新华+龙+阳+魏霜+张娜+陈文+杨卓瑜
摘要：使用ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK等序列对截获的10种苍耳属（Xanthium）杂草进行扩增测序，比较各序列的扩增和测序效率，采用最近距离法和相似性搜索算法评价不同序列的鉴定效率。采用最佳鉴定序列计算种间K2P距离并构建系统进化树。结果表明，ITS、psbA-trnH 2个序列的扩增效率和鉴定效率最高；ITS序列的种间变异最大，其次是psbA-trnH序列，matK序列的种间变異最小；ITS序列的Neighbor-Joining（NJ）树可明显地将不同苍耳属杂草种分开；psbA-trnH序列可明显地将国内苍耳种和检疫性苍耳种分开。说明利用DNA条形码能够准确地鉴别苍耳属杂草，ITS和psbA-trnH序列是鉴别苍耳属杂草较理想的条形码组合。该研究结果为苍耳属杂草的分子鉴别提供了科学依据与新的思路。
关键词：psbA-trnH；ITS；DNA条形码；苍耳属；杂草鉴定
中图分类号：S451 文献标志码：A 文章编号：1003-935X（2016）03-0011-06
Identification of Ten Xanthium weeds Using DNA Barcoding Sequences
YUAN Junjie1，MA Xinhua1，LONG Yang1，WEI Shuang2，ZHANG Na1，CHEN Wen1，YANG Zhuoyu1
（1.Zhanjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang 524022，China；
2.Shantou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou 515000，China）
Abstract：DNA from ten weed species of the genus Xanthium was amplified and sequenced using five candidate sequences （ITS＼ITS2＼psbA-trnH＼rbcL and matK）. The PCR amplification and sequencing efficiencies were compared and the identification efficiency was assessed using BLAST1 and Distance methods. The best identification of sequence was analyzed and the NJ tree was constructed. The amplification and sequencing efficiencies of ITS，psbA-trnH were the best. ITS showed the largest interspecific variation，followed by psbA-trnH sequence； matK was the worst. The ten species of Xanthium weeds could be distinguished by ITS2 region using inter-specific K2P genetic distance and NJ tree. Quarantine and common Xanthium plants could be distinguished by psbA-trnH region. Using DNA barcode can accurately identify ten species of Xanthium weeds. ITS2 and psbA-trnH could be used as a potential DNA barcode combination to correctly identify the Xanthium weeds. The research provides scientific basis and new ideas for the molecular identification of Xanthium weeds.
Key words：psbA-trnH；ITS；DNA barcode；Xanthium；weed identification
苍耳属（Xanthium）为双子叶纲菊科植物，全球约有25种[1]，苍耳属（非中国种）杂草为我国禁止进境的植物检疫性有害生物[2]，其适应性强、竞争力强、繁殖力强，与农作物争夺生存空间，幼苗具有毒性，且总苞具钩状的硬刺，易划破动物的皮肤，威胁牲畜健康。苍耳属杂草危害较大，一直是世界各国重点关注的恶性杂草，在口岸防止苍耳属杂草的入侵具有重要意义。然而在进出口货物中，苍耳属杂草一般以籽实的形态混杂于粮谷类产品及其包装物中，种类繁多，近似种相似性较高，鉴定困难；且苍耳属杂草籽在运输过程中总苞表面坚硬的刺以及密布的柔毛等重要鉴定特征会发生较大磨损，这就给形态学鉴定带来很大的难度[3-4]。因此，建立稳定且准确的分子生物学分类方法作为形态学鉴定的补充方法具有重要意义。
DNA条形码（DNA barcoding）由加拿大动物学家Hebert 等首次提出[5]，具有不受个体形态特征限制、不受个体发育阶段影响、从基因水平上客观区分物种、操作方法相对简便等特点[6-10]，是近十几年来研究进展最迅速的学科之一[11]，其通用序列的筛选一直是该领域研究的热点问题。2009年，生命条形码联盟植物工作组（the plant working group of the consortium for the barcode of life，CBOL）分析了550个物种907个样品后，推荐以复合序列rbcL+matK作为整个植物界的DNA条形码序列，但其在物种水平的鉴定成功率仅为72%[12]，所以仍在进行验证和新序列的研究工作。
目前DNA条形码在植物类群中的研究和应用还处于起步阶段。理想的条形码序列在单一科属内大量近缘物种鉴别时应具备准确性和高效性，同时在大量科属间进行物种鉴别时应该具有通用性。尽管已有学者在近缘属、种中开展植物条形码的研究工作[13-16]，但在被考察序列受关注程度、样本的数目、取样密度及代表性、候选序列的评价指标等方面存在一定的局限性。学者们推荐了几种植物的DNA条形码候选序列及其组合[17-19]，但这些序列是否适合每一个具体的植物科或属，尚需进行针对性的探索研究。在此背景下，本研究选取近年来几个重点推荐的序列，如ITS、ITS2、rbcL、matK以及psbA-trnH，比较其对苍耳属杂草种类的鉴别能力，考察各候选序列作为该属杂草DNA条形码通用序列的适用性，以期为DNA条形码技术在苍耳属杂草籽鉴定中的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用苍耳属杂草籽从近5年的进境粮谷（美国黄大豆、巴西黄大豆、乌克兰玉米、澳大利亚油菜籽、加拿大油菜籽、美国高粱等）中截获（表1）。经中国检验检疫科学研究院鉴定，凭证标本保存于湛江出入境检验检疫局。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用改良后的DNeasy Plant Mini Kit试剂盒法提取DNA，参照试剂盒说明书进行操作。
1.2.2 PCR扩增和電泳检测 PCR反应使用宝生物工程（大连）有限公司rTaq酶进行扩增，反应采用50 μL体系：3 μL DNA模板，5 μL 10×PCR Buffer，4 μL dNTPs，0.25 μL rTaq，各1 μ上、下游引物（表2），补充ddH2O至50 μL。ITS、ITS2、rbcL采用相同的PCR条件：95 ℃、4 min；94 ℃、30 s，52 ℃、45 s，72 ℃、45 s，35个循环；72 ℃、10 min。matK的PCR条件：95 ℃、4 min；94 ℃、45 s，52 ℃、1.5 min，72 ℃、1.5 min，35个循环；72 ℃、10 min。psbA-trnH的PCR条件：95 ℃、4 min；94 ℃、30 s，52 ℃、1 min，72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃、10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像分析系统进行分析。
使用ABI3730XL测序仪（Applied Biosystems Co.，USA）直接对PCR产物进行双向测序。利用序列拼接软件CodonCode Aligner V3.7.1对测序峰图文件进行拼接，去除引物区及低质量序列。使用Clustal（MEGA 5.0）软件对拼接后的序列进行比对分析。运用相似性搜索算法（BLAST1）和最近距离法（K2P nearest distance）考察各序列的鉴定成功率。整合处理后结合样品序列，并运用MEGA 5.0建立Neighbor Joining（NJ）树，分析苍耳属各样本的亲缘关系。
2 结果与讨论
2.1 序列信息及鉴定成功率
从表3可以看出，5条片段的 PCR 扩增效率和测序效率均较高，除matK的扩增效率为56.0%，测序效率为88%外，其他片段的扩增和测序效率均高于90%，其中ITS、ITS2、psbA-trnH扩增和测序效率均高于95%。片段长度方面，ITS2 的长度最短，为 494～498 bp；其次是 psbA-trnH，为 521～543 bp；rbcL 和 ITS 较长，分别为 720 bp 和 720～727 bp；matK最长，为844 bp。各片段的 GC 量以psbA-trnH的最低，为 26.5%～26.9%；ITS2的最高，为 548%～56.4%。psbA-trnH与ITS序列均有53个变异位点，其次为ITS2，包含26个变异位点，matK和 rbcL 分别有7、3个变异位点。psbA-trnH有22 bp的插入/缺失，为5个序列中最多的。
2.2 鉴定效率分析
采用Distance 和BLAST1方法分析不同DNA条形码序列对10种苍耳属杂草籽的鉴定效果，结果如表4所示，应用ITS序列2种方法的鉴定成功率均最高，分别为94%、99%；其次是psbA-trnH，鉴定成功率分别为 92%、89%；ITS2稍差于 psbA-trnH，鉴定成功率为 91%、86%；而rbcL和matK的鉴定效率较低，2种方法的成功率均不足40%。
2.3 10种检疫性苍耳属杂草的psbA-trnH和ITS序列分析
2.3.1 K2P遗传距离 同一地区样本个体之间序列完全相同，种内K2P遗传距离为0。利用 MEGA 7.0 软件，采用 Kimura 2-parameter model模型计算种间遗传距离（表4），苍耳属植物ITS序列的遗传距离最高值为 0.068 0，是苍耳与沃式苍耳的遗传距离；最小值为 0.000 0，是河岸苍耳与宾州苍耳，意大利苍耳与球果苍耳，西方苍耳与意大利苍耳、球果苍耳的遗传距离。这说明国内苍耳与各检疫苍耳之间存在较大的遗传距离，存在较大的遗传差异；河岸苍耳与宾州苍耳，意大利苍耳与球果苍耳，西方苍耳与意大利苍耳、球果苍耳之间遗传距离为0，不存在遗传差异。
同一地区样本个体之间序列完全相同，种内K2P遗传距离为0。利用 MEGA 7.0 软件，采用Kimura 2-parameter model模型计算种间遗传距离（表5），苍耳属植物 psbA-trnH 序列的遗传距离最高值为0.093 5，是刺苍耳与柱果苍耳、意大利苍耳、河岸苍耳的遗传距离；最小值为 0.000 0，是北美苍耳与球果苍耳、宾州苍耳、西方苍耳、沃式苍耳之间及柱果苍耳与意大利苍耳、河岸苍耳之间的遗传距离。这说明北美苍耳与球果苍耳、西方苍耳、宾州苍耳、沃式苍耳之间不存在遗传差异。
2.3.2 Neighbor-Joining（NJ）树 利用 MEGA 70 软件，采用 Neighbor-Joining 方法构建系统发育树。基于 ITS 序列（图1），苍耳、刺苍耳被分为一支，并且存在遗传距离，各自成一支；宾州苍耳、河岸苍耳被分为一支；柱果苍耳独成一支；意大利苍耳、球果苍耳、西方苍耳被分为一大支；北美苍耳、沃式苍耳各自独成一支；从 NJ 树图可以看出，10种苍耳属杂草均可以互相区分，可直观地展现不同序列的物种鉴别情况。
基于psbA-trnH序列（图2），苍耳、刺苍耳被分为一支；柱果苍耳、意大利苍耳、河岸苍耳被分为一支；北美苍耳、球果苍耳、宾州苍耳、沃式苍耳、西方苍耳被分为一支；对其进行 Bootstrap检验，其分组支持率为100%，说明这3支苍耳属杂草在系统进化发育中是相互独立的。柱果苍耳、意大利苍耳、河岸苍耳又被划分为不同级别的3个分支，但其Bootstrap检验支持率较低，说明这3种苍耳属杂草独立性相对较弱。北美苍耳、球果苍耳、宾州苍耳、沃式苍耳、西方苍耳也被分为各自独立的分支，但其Bootstrap检验支持率较低，说明这5种苍耳属植物独立性相对较弱。
由以上数据可以得出，ITS序列构建的NJ树
可以对10种苍耳属杂草籽进行区分，相对于psbA-trnH 序列的区分度更高，更加适用于苍耳属杂草的鉴别。
3 讨论
本研究比較分析了ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK等5条DNA条形码序列对10种苍耳属杂草籽的鉴别情况。综合比较可以看出，ITS、ITS2、psbA-trnH序列的鉴定效率较高，遗传距离较大，鉴定成功率较高，较适合作为鉴别苍耳属杂草籽的条形码序列。
苍耳属是菊科的一个大属，种类繁多，其非我国种均为我国禁止进境的植物检疫性有害生物，危害性极大。由于同属杂草种外部形态极其相近，在口岸检疫时易误鉴定为国内种而引入。DNA 条形码是依靠 DNA 片段上承载的序列信息的不同，对物种进行快速、准确鉴定的新方法，在本研究中国际DNA条形码鉴定联盟组织CBOL推荐的rbcL、matK序列均较保守，序列种内种间的重叠较大，两者均不适用于10种苍耳属杂草籽的鉴定。psbA-trnH是进化速率较快的基因间隔区之一，两端具有较为保守的psbA和trnH，该序列的显著特点是存在较多的插入/缺失，用psbA-trnH序列上的信息位点成功鉴定了国内苍耳与国外苍耳籽，但无法有效区分国外苍耳籽。本研究中北美苍耳、球果苍耳、宾州苍耳、沃式苍耳、西方苍耳有22个碱基的缺失，其他苍耳属植物均无。在此情况下，采用ITS、ITS2序列进行补充研究，ITS和ITS2 是位于nrITS 序列上5.8S～26S 核糖体 DNA 的内转录间隔区，具备了 5.8S和26S两端的保守区设计通用引物，该序列最早被应用于系统发育和物种的分类研究中[20-22]，包含丰富的变异位点和信息位点，可以用于对物种进行鉴定。研究发现，10种苍耳属杂草籽psbA-trnH 的种间变异、鉴定成功率均与ITS2序列持平，但均小于ITS序列。本研究中ITS在10种苍耳属杂草籽的PCR扩增效率和测序成功率均高于95%，基于BLAST1和 Distance 方法的鉴定效率达到90%以上，通过分析10种苍耳属杂草籽ITS种间 K2P 遗传距离和NJ树可以看出，ITS序列均可准确鉴定苍耳等10种苍耳属杂草籽。
结果表明，采用ITS序列鉴定中，国内苍耳仅与刺苍耳遗传距离较近，区分度较低，但国内苍耳与其他检疫性苍耳均具有显著区别，可以通过ITS序列进行鉴定区分，且区分度较高；NJ树分析均可将各物种区分开来，且差异显著。psbA-trnH序列也能同时单独鉴定出10种苍耳属杂草籽，能明显区分出国内苍耳与检疫性苍耳，但各检疫苍耳区分度较低。两者在鉴定能力上可互为补充，组合鉴定可以得出一个更为准确的鉴定结论。综上所述，采用ITS和psbA-trnH可以作为组合DNA条形码应用于苍耳属杂草籽的检疫工作当中。
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