曾博雅
摘 要 目的：采用凝胶法测定10%中/长链脂肪乳注射液（C8-24Ve）和30%脂肪乳注射液（C14-24）中的细菌内毒素。方法：根据《中国药典2015年版四部》1143细菌内毒素检查法，先调节供试品pH值，再进行干扰试验，确定10%中/长链脂肪乳注射液8倍稀释液无干扰作用，30%脂肪乳注射液原液无干扰作用。结果：在调节pH值至中性后，10%中/长链脂肪乳注射液8倍稀释液对细菌内毒素试验无干扰，30%脂肪乳注射液原液对细菌内毒素试验无干扰。结论：凝胶法可用于10%中/长链脂肪乳注射液（C8-24Ve）和30%脂肪乳注射液（C14-24）中的细菌内毒素检查。
关键词 中/长链脂肪乳注射液;脂肪乳注射液;细菌内毒素检查法;凝胶法
中图分类号： R927文献标识码： A
DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.02.058
近年来，10%中/长链脂肪乳注射液作为肠外营养药，用于口服或肠内营养不能或不够时补充能量和必需脂肪酸。30%脂肪乳注射液是能量补充药，是静脉营养的组成部分之一，为机体提供能量和必需脂肪酸，用于胃肠外营养补充能量及必需脂肪酸，预防和治疗人体必需脂肪酸缺乏症，也为经口服途径不能维持和恢复正常必需脂肪酸水平的病人提供必需脂肪酸。30%脂肪乳注射液更适合输液量受限制和能量需求高度增加的病人。其应用越来越广泛。因其是静脉输注，所以要测定细菌内毒素含量，确保在规定范围内，防止热原反应，以保证产品的品质和质量。本文采用凝胶法对10%中/长链脂肪乳注射液（C8-24Ve）和30%脂肪乳注射液（C14-24）中细菌内毒素进行检查。
1 試验药品试剂及仪器
10%中/长链脂肪乳注射液（C8-24Ve）（西安立邦制药有限公司，批号：1808262，规格：250ml）; 30%脂肪乳注射液（C14-24）（西安立邦制药有限公司，批号：1807082，规格：250ml）;鲎试剂（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1701190，灵敏度0.06EU/ml; 批号：1703141，灵敏度0.5EU/ml）;细菌内毒素检查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1704100）;细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号：150601-201783，效价：80EU/支）。智能恒温加热仪;梅特勒PH测试仪;涡旋混合仪。
2 方法与结果
2.1 细菌内毒素限值的确定
根据《国家食品药品监督管理局标准YBH04342012》和《卫生部药品标准化学药品二部第六册》，两种注射剂均为每1ml中含内毒素的量应小于0.5EU。
2.2 鲎试剂灵敏度复核
根据《中国药典2015年版四部》[1]1143细菌内毒素检查法进行鲎试剂灵敏度复核试验。
使用灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂。将细菌内毒素工作标准品用检查用水溶解稀释制成1、0.5、0.25、0.125EU/ml四个浓度的内毒素标准溶液。取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16支分别加入0.1ml上述不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4支;另外2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。加样完成后，在涡旋混合仪上轻划三下混匀，封口膜包覆管口，竖直放入37℃的智能恒温加热仪中，保温60分钟。
使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂。将细菌内毒素工作标准品用检查用水溶解稀释制成0.125、0.06、0.03、0.015EU/ml四个浓度的内毒素标准溶液。按照上述方法一组四个平行样，阴性对照两个样。试验结果见表1。
表1结果表明，鲎试剂复核结果均在0.5～2λ，灵敏度符合规定。
2.3 调节pH值
根据厂家经验，脂肪乳注射液的pH值一般在8左右，经PH计测定，此10%中/长链脂肪乳注射液（C8-24Ve）的pH值为7.930，30%脂肪乳注射液（C14-24）的pH值为8.406，我们用配置好的盐酸调节pH值。将1ml浓盐酸加入到4ml的检查用水中，共计5ml，为酸性调节剂，配置过程所用的器皿都为灭过内毒素的。加一滴酸性调节剂到整瓶10%中/长链脂肪乳注射液（C8-24Ve）的供试品中，摇匀，倒出一小杯，再次测定其pH值为7.391，为中性。
加两滴酸性调节剂到整瓶30%脂肪乳注射液（C14-24）的供试品中，摇匀，倒出一小杯，测定其pH值为7.808，还未到中性，再加一滴酸性调节剂到整瓶30%脂肪乳注射液（C14-24）的供试品中，摇匀，倒出一小杯，测定其pH值为7.390，为中性。调节好PH的供试品作为供试液进行下列试验。
2.4 干扰试验预实验
根据《中国药典2015年版四部》1143进行试验，取10%中/长链脂肪乳注射液（C8-24Ve）和30%脂肪乳注射液（C14-24）调节好PH的供试品，使用灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂，分别用检查用水将供试品配制成原液、2倍稀释液、4倍稀释液、8倍稀释液，供试品阳性对照为每一稀释倍数下，该供试品稀释液将细菌内毒素标准品制成2λ（1EU/ml）浓度，阳性对照为检查用水制成的2λ（1EU/ml）内毒素标准溶液，阴性对照为检查用水。试验结果见表2。
表2结果表明，10%中/长链脂肪乳注射液8倍稀释液对细菌内毒素无干扰，可使用8倍稀释液进行干扰试验。30%脂肪乳注射液原液对细菌内毒素无干扰，可使用原液进行干扰试验。
同时，用不调节pH值的10%中/长链脂肪乳注射液（C8-24Ve）供试品原液进行干扰预实验，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂，用检查用水将供试品配制成8倍稀释液，阳性对照为0.125EU/ml内毒素溶液，供试品阳性对照为以供试品液稀释的0.125EU/ml的内毒素溶液，阴性对照为检查用水。试验结果见表3。
用不调节pH值的30%脂肪乳注射液（C14-24）供试品原液进行干扰预实验，使用灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂，取原液，阳性对照为1EU/ml内毒素溶液，供试品阳性对照为以供试品液稀释的1EU/ml的内毒素溶液，阴性对照为检查用水。试验结果见表3。
表3结果表明，10%中/长链脂肪乳注射液调节pH值后的供试品8倍稀释液对细菌内毒素无干扰，应用调节pH值后的供试品作为供试液。30%脂肪乳注射液调节pH值后的供试品原液对细菌内毒素无干扰，应用调节pH值后的供试品作为供试液。
2.5 干扰试验
根据《中国药典2015年版四部》1143细菌内毒素检查法，10%中/长链脂肪乳注射液，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂，将调节过pH值的供试品制成8倍稀释液，用检查用水将内毒素工作标准品稀释至0.125、0.06、0.03、0.015EU/ml，另用8倍稀释液将内毒素工作标准品稀释至0.125、0.06、0.03、0.015EU/ml。试验结果见表4。
30%脂肪乳注射液，使用灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂，将调节过pH值的供试品，用检查用水将内毒素工作标准品稀释至1、0.5、0.25、0.125EU/ml，另用调节过pH值的供试品原液将内毒素工作标准品稀释至1、0.5、0.25、0.125EU/ml。试验结果见表4。
表4结果表明，10%中/长链脂肪乳注射液在调节pH值后，8倍稀释液对细菌内毒素试验无干扰。30%脂肪乳注射液在调节pH值后，原液对细菌内毒素试验无干扰。
2.6 细菌内毒素检查
10%中/长链脂肪乳注射液，按照限值0.5EU/ml，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂，用自配的盐酸调节供试品pH值，进行细菌内毒素检查。30%脂肪乳注射液，按照限值0.5EU/ml，使用灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂，用自配的盐酸调节供试品pH值，进行细菌内毒素检查。结果见表5。
表5结果表明，该批10%中/长链脂肪乳注射液细菌内毒素检查。符合规定。该批30%脂肪乳注射液细菌内毒素检查。符合规定。
3 结果
10%中/长链脂肪乳注射液在调节pH值至中性后，8倍稀释液对细菌内毒素试验无干扰。该批供试品检查结果符合规定。
30%脂肪乳注射液在调节pH值至中性后，原液对细菌内毒素试验无干扰。该批供试品检查结果符合规定。
4 讨论
《中国药典2015年版四部》1143细菌内毒素检查法有两种方法，包括凝胶法和光度测定法，光度测定法又包括浊度法和显色基质法。脂肪乳注射液现企业多采用显色基质法进行测定。但凝胶法操作简单，经济，适用范围广，为第一法，也是我国法定仲裁法[2]。有报道[3-5]，中/长链脂肪乳注射液对鲎试剂凝集反应有干扰作用。中/长链脂肪乳注射液含有大豆油、中链甘油三酸酯、卵磷脂[6]、甘油等成分，影响因子多，供试品阳性对照不容易凝的好。可能是与其所带电荷干扰鲎试剂凝集反应有关[2]。本实验先调节供试品的pH值，使其呈中性，可能是使其所带电荷趋于稳定，减少干扰作用。再将10%中/长链脂肪乳注射液供试品稀释至8倍，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂，无干扰作用。
而30%脂肪乳注射液供试品原液，无需稀释，稀释后供试品阳性反而凝的不好，可能是由于脂肪乳注射液含有大豆油、卵磷脂、甘油等成分，其较多油性成分，稀释时加入检查用水，形成油水混合，反而破坏了稳定性，实验中发现使用灵敏度从高的到低的鲎试剂，供试品阳性凝的越来越好：0.03EU/ml鲎试剂，供试品阳性呈水状，水油分层，形成不了凝胶。使用0.06EU/ml鲎试剂，供试品阳性呈半凝固状。使用0.125EU/ml鲎试剂，供试品阳性刚开始呈凝胶状，缓慢倒转180°还是会滑脱。只有使用0.5EU/ml鲎试剂，供试品阳性呈稳定的白色凝胶状，缓慢倒转180°不变形，不从管壁滑脱。因此30%脂肪乳注射液在调节pH值至中性后，原液对细菌内毒素试验无干扰作用。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：1143.
[2]王文佳，陈志明，张纳敏，等.凝胶法测定脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液中的细菌内毒素.[J]中国药房，2017，28（18）：2576-2578.
[3]李雪兰，黄新兰，翟艳，等.脂肪乳注射液细菌内毒素检查法的可行性研究[J].中国医药指南，2010，8（11）：53-54.
[4]余洋，赵志龙，戴政宁.长链脂肪乳注射液（00）细菌内毒素检查试验[J].临床医药文献杂志，2016，3（23）：4704-4705.
[5]賈旭明，黄明.鲎试验测定长链脂肪乳注射液中细菌内毒素的方法学研究[J].四川生理科学杂志，2008，30（4）：158-159.
[6]王汝涛，陈涛，王惟娇.国产卵磷脂辅料对脂肪乳制剂质量的影响研究[J].中国药业，2007，16（23）：5-6.
