霍雨艳 饶冬梅
摘 要
目的：构建在哺乳动物细胞中表达的-Omi/HtrA2基因融合表达载体，为后续研究Omi/HtrA2基因过表达对结肠癌细胞HT29的影响奠定基础。方法：PCR扩增HtrA2基因编码框，用KpnI和BamHI将TS- HtrA2及目的载体pEC3.1（+）两步法双酶切，然后进行连接转化，构建基因重组载体radE5- HtrA2，包装重组腺病毒，RT-PCR 检测重组腺病毒基因mRNA的表达并提取蛋白进行Western blot 检测。结果：重组真核表达载体radE5- HtrA2经限制性内切酶分析，双酶切之后的条带与理论值相符，测序结果未见碱基变异，提取转染后细胞总蛋白进行Western blot 检测，可测到目标条带。结论：成功构建了基因重组载体radE5- HtrA2，并能在结肠癌细胞HT29中正常表达，为后续研究Omi/HtrA2基因功能奠定基础。
关键词
omi/HtrA2;结肠癌;重组质粒;转染
中图分类号： R735.35 文献标识码： A
DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.16.084
0 前言
丝氨酸蛋白酶Omi又称Htr A2，在机体各组织器官中普遍表达，并在细胞质和线粒体中与多种底物蛋白发生反应[1]。目前研究发现Omi/HtrA2与多种疾病的发生发展密切相关，在肿瘤中高表达，其表达与肿瘤的发生、发展以及预后关系密切[2]。Omii通过其IAP结合位点与IAPs的BIR域结合，以便使已结合caspase的BIR域释放caspase，使其恢复活性而使细胞凋亡[3]。本研究通过构建Omi表达载体转染入结肠癌细胞HT29中，检测其表达情况，为后续研究该基因高表达对结肠癌细胞HT29的影响奠定基础。
1 材料与方法
1.1 HT29细胞培养
细胞培养在DMEM（GibcoBRL）+10%灭活胎牛血清（FBS）（Gibco）+双抗（青霉素100U/ml+链霉素100ug/ml）的培养基中，37℃，5%CO2的培养条件，用25cm2的组织培养瓶单层培养，并定期用1%胰酶-EDTA溶液分离细胞进行传代培养，传代比例1：2～1：3。
1.2 实验材料试剂与仪器设备
HT29细胞（佳木斯大学友情提供），DMEM（GibcoBRL），10%灭活胎牛血清（FBS）（Gibco），双抗（Sigma），胰酶（Sigma），PBS（Sigma），荧光显微镜（OLYMPUS ），37℃细胞培养箱（SANYO），低速离心机（TD5A- WS式），Adenovirus expression System重组腺病毒构建系统（genesil），T4 DNA Ligase及部分内切酶（NEB公司），部分内切酶（Takara），HEK 293（美国ATCC），质粒提取试剂盒（维特洁），PCR仪（ABI）。
1.3 HtrA2基因表達载体构建
1.3.1 PCR扩增HtrA2基因
引物对：HtrA2-f：5'-GG GGTACC acccctgacctccgg-3'K pnI HtrA2-r：5'-GG GATCC GGCAGCTCATTTTC--3'EcoRI，Product：Length=2006bp;模板：pX-CMV- HtrA2载体;循环参数：预变性94℃ 5min，变性94℃ 20s，退火58℃ 25s，延伸72℃ 2min 30 cycles，72℃ 3min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
1.3.2 连接PCR产物至T（中间过渡）载体
反应体系：Pmd-19T simple vector 0.5μl，HtrA2 （PCR产物） 4.5μl，Ligation Mixture 5μl，16℃，过夜。连接产物转化至DH5α中，挑取克隆进行BamHI，KpnI双酶切鉴定。
1.3.3 亚克隆HtrA2至穿梭载体pEC3.1（+）
用KpnI和BamHI将TS- HtrA2及目的载体pEC3.1（+）两步法双酶切，然后进行连接，连接产物命名为pEC3.1-HtrA2（见图1），载体结构：---attL1—CMV—HtrA2—IRES---EGF P—stop---attL2-连接产物转化至DH5α中，挑取克隆进行鉴定。
1.3.4 通过LR体外同源重组将HtrA2表达框转移至pGSad eno（radE5）腺病毒（见图2）表达载体上
（1）LR体外同源重组：将它命名为radE5- HtrA2。
（2）蛋白酶K消化重组酶，加入1μL蛋白酶K，37℃反应15min。
（3）将5μL上步反应产物转化感受态细胞DH5а，涂布于含Ampr抗性（终浓度为100μg/ml）的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于50ml含Ampr抗性（终浓度为100ug/ml）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250rpm）培养过夜。
（4）用中提试剂盒提取质粒，对提取的质粒进行酶切鉴定。
1.4 包装重组腺病毒
（1）准备进行转染的线性化腺病毒DNA
用PacI酶切重组腺病毒质粒;酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀。
（2）将PacI线性化的腺病毒DNA转染HT29
（3）培养的HT29，出现明显的CPE现象，且有>50%脱壁时即收细胞进行裂解收病毒，裂解上清感染HT29。
（4）放大培养重组腺病毒
当细胞有明显的CPE现象，且有>50%脱壁时即收细胞进行裂解，收病毒于1 ml 无菌PBS中。
（5）腺病毒radE5-HTRA2感染HT29细胞
感染前一天接种6孔细胞培养板，第二天细胞量达到70%-80%密度;感染前将细胞更换培养基为无血清无双抗的DMEM，将病毒放在冰盒上慢慢融化，按确定的最适体积加入细胞中，分别设MOI=0.1、MOI=1、MOI=10、MOI=100、MOI=500组轻轻混匀，5% CO2 37℃ Incubator中培养过夜。观察感染病毒后荧光表达，计数荧光百分率，细胞分别在转染后24h、72h、96h收集细胞样品进行RT-PCR和Western blot检测。
2 结果
2.1 PCR扩增HtrA2基因凝胶电泳结果
目的基因长度：2006bp，由下图可见，扩增的基因为目的基因。（见图1）
2.2 连接PCR产物至T载体进行酶切鉴定结果
由图2看出克隆1，克隆2，克隆3均为正确条带，小条带大小为1Kbp，选取克隆1（TS-HtrA2）测序。测序结果显示，扩增得到的HtrA2片段有一碱基突变，但不影响氨基酸序列，故可以此克隆进行后续实验。
2.3 亚克隆HtrA2至穿梭载体pEC3.1（+）后酶切鉴定
BamH，KpnI双酶切鉴定结果如下（见图3）（应该切出一约2Kbp的条带），图片可见克隆①②均为正确克隆，命名为pEC3.1-HtrA2。
2.4 PI-SceI/I-CeuI双酶切radE5-HtrA2电泳
通过LR体外同源重组将HtrA2表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体（radE5）上，PI-SceI/I-CeuI双酶切radE5-Htr A2电泳图谱（见图4），酶切分析：正确的克隆将切出一条3kb的小条带，且大带大于15kb（说明载体为腺病毒载体），由图4可知目的克隆是正确的，质粒构建成功。
2.5 RT-PCR测定HtrA2重组腺病毒基因蛋白表达
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定HtrA2重组腺病毒基因蛋白表达良好（见图5）。
2.6 Western检测HtrA2重组腺病毒基因蛋白表达
Western-blot 检测rAdE5-HTRA2感染HT29细胞后蛋白表达良好（见图6）。
3 讨论
结肠癌是一种常见的恶性消化道疾病，近几年在国内发病率逐年升高。结肠癌患者生存率偏低，治疗效果及预后均较差，严重影响健康[4]。目前临床上治疗结肠癌主要以手术为主，早期可通过手术切除进行根治，但大部分结肠癌患者发现时已是晚期，常规手术无法根治，因此寻找新的治疗手段具有重要意义[5-6]。结肠癌的发生发展与多种因素有关，包括癌基因和抑癌基因的表达[7-9]。
丝氨酸蛋白酶Omi，隶属于Htr A（High Temperature Req uirement A）家族，又称Htr A2，在机体各组织器官中普遍表达，并在细胞质和线粒体中与多种底物蛋白发生反应。Omi/Htr A2作为促凋亡蛋白，可降解细胞内重要的凋亡抑制蛋白，进而导致细胞凋亡，Omi可通过与线粒体的抗凋亡蛋白HAX-1相互作用，使HAX-1降解，从而增加细胞对凋亡刺激的敏感性[10-12]，诱导细胞凋亡。本实验通过体外构建Omi基因表达重组载体radE5- HtrA2，转染入结肠癌细胞HT29中并能正常表达，为后续研究Omi/HtrA2基因过表达与肿瘤细胞凋亡的关系奠定基础，为进一步动物实验以及结肠癌的临床治疗提供基础研究依据。
参考文献
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