槐玉英 宋瑞龙
摘 要
活细胞工作站可为体外细胞提供生存环境并维持细胞在较长时间内的正常生长繁殖，该设备便于细胞内或细胞间物质代谢的追踪观察，现已成为生物学领域中的一种热门研究手段。本文概述了该设备的操作方法及常见问题，供大家参考。
关键词
活细胞工作站;样品制备;应用;常见问题
中图分类号： Q2-33 文献标识码： A
DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.16.085
Abstract
The live cell imaging system can provide a living environment for cells in vitro and maintain the normal growth and reproduction of cells for a long time.It is convenient for tracking and observing the metabolic of intracellular or intercellular substance.It has become a popular research method in the biological field.This paper outlines the operation and common problems of the live cell imaging system.
Key Words
Live cell imaging system;Sample preparation;Application;Common problems
活细胞工作站是在倒置荧光显微镜基础上实现长时间、连续观察活细胞培养并能连续采集图像的成像系统，可对细胞内或细胞间的物质代谢或信息传递进行动态观察。目前该设备常应用于观察细胞的增殖、迁移（1）、凋亡（2）、内吞（3）等过程，可在亚细胞水平观察线粒体、内质网等细胞器在细胞内的动态变化，还可观察病毒感染细胞后核衣壳的转运情况（4）或某些蛋白在病毒感染细胞内的转运（5）等。该设备可以对多孔板或培养皿内的活细胞进行明场或荧光观察，也可对固定玻片的样品进行观察，特别适用于对活细胞和组织、沉淀物等进行显微研究，本文以我院购买的活细胞工作站为例，对设备配置及使用过程中的常见问题进行介绍、归纳。
1 活细胞工作站的技术参数
1.1 荧光显微镜主要参数
配备的蔡司新一代Axio Observer7全自动倒置荧光显微镜可以自动校准物镜，能够校正由于厚度、介质折射率不同引入的相差;配备了6款不同功能的物镜，5×、10×、20×（平场复消色差物镜）、20×（长工作距离平场消色差相差物镜，LD）、40×（LD）、63×（平场复消色差物镜）;电动调焦，最小步进≤10nm，调焦行程≥10mm;分体式TFT触摸屏，操作方便;具有很强的扩展性，可以搭配不同的配件使用，可提供多样灵活的显微镜应用平台。
1.2 光学系统
采用新ICCS无限远光学系统，具有轴向和径向双重色差校正，可反差校正，提高图像对比度。
1.3 荧光系统
配有四色LED荧光光源，具有寿命长，亮度高、色温恒定、照明均匀，不产生热量，避免“杂光”漂白/光毒性，可瞬间开启或关闭，无须预热或冷却的特点;配有多通道荧光滤块，拍多通道时只需切换不同激光即可，滤块不需要切换，两者的结合实现了无转盘设计。
1.4 聚焦系统
具有内部自动聚焦透镜，能实现大范围内寻找并锁定和记忆多个焦面，支持自动拼图和多位点采图过程的多点漂移补偿（不同位置可设置不同聚焦补偿offset参数）。采用光栅投影方式监测焦面的位置变化。
1.5 活细胞培养装置
独立的细胞培养环境，合适的温度、二氧化碳、湿度保证细胞可长时间存活。
1.6 软件
具备基本的图像处理功能，可测定某一区域平均荧光强度值，测量某一直线或曲线的荧光强度分布情况等，对样品进行时间序列拍摄、Z轴序列拍摄、图像景深扩展、自动拼图等。
2 样品的制备
2.1 样品的处理
石蜡组织切片或冷冻组织切片样品经常规的免疫荧光抗体标记、封片后即可进行观察。
进行活细胞观察时，应保证无菌操作，宜选用厚度为0.17mm的激光共聚焦培养皿。对于贴壁性较差的细胞可对培养容器进行多聚赖氨酸包被处理。
2.2 荧光染料的选择
在活细胞的动态观察时，须选择稳定性好，抗淬灭性强，且对细胞状态影响小的荧光染料，如进行DNA染色时，应选用Hoechst，而不用对细胞毒性较大的DAPI。
该设备可进行多荧光多通道观察，但要避免在同一样品中使用相近光谱的荧光染料，以免造成串色。
3 图像采集
3.1 单张图片采集
在“Locate”或“Acquisition”界面进行圖像预览，设置曝光时间，获取最佳图片。在“Dimensions”菜单中“Range Indicator”前打勾，作为曝光时间参考，红色代表过爆点。
3.2 多通道图片采集
在“Acquisition”界面下，选中对应的荧光通道进行预览，通过显微镜或者按住键盘“Ctrl”滑动鼠标滑轮调节焦面，手动或自动调节曝光时间，切勿过爆。使用Apotome，通过栅格移动将非焦面的光挡住，从而获得较高信噪比的图片。使用自动曝光功能时，在测完曝光时间后就关掉，否则相机一直处于自动测量曝光时间状态。点击拍照并保存。
3.3 Z轴序列图片采集
选中“Z-Stack”，调整焦距，确定拍摄目标的上限和下限，根据实验设置扫描步进，调节各通道参数，点击开始实验，完成Z轴序列图片采集。点击图片左侧的“Ortho”，选中图片下方的最大信号强度投影（MIP），从而生成三维重构图片。此功能适于较厚样品的观测。
3.4 自动拼图
选中“Tiles”，进入预览和整个载物台视野的分屏界面，通过输入数值或移动载物台到需要采集区域的边界来确定拼图区域，并进行多点设置。预览所选区域大小合适后开始实验进行拼图。如果所需拼图区域比较大，可先使用低倍物镜进行区域设置，然后选择高倍物镜，之前的Tile拼图数目会自动随之改变（保持原区域不变），再根据实时预览图片调好焦和各通道曝光时间进行拼图。用软件的处理功能可以对拼图进行处理和分析。如果拼图的视野不平，选择合适的聚焦策略。
3.5 手动拼图
调整好各通道参数，开始实验获取一实时的全景图，滚动鼠标滚轮放大或缩小区域，调焦获取图片;软件会自动生成另一预览蓝框，可拖动蓝框修改拼图视野，获取图片，重复多次直至完成全部拼图采集;以上的图片采集结束后，利用软件进一步处理后重新输出方完成。由于拼图需要对载物台和相机的相对位置进行精确校正，所以不要碰撞载物台和随意拧动相机。
3.6 时间序列图片采集
选中“Time Series”，根据实验需要设置拍摄的时间间隔和总时间，点击开始实验进行时间序列采集。
3.7 Z轴序列+拼图
选中“Z-Stack”和“Tiles”，调整各通道拍摄参数后，在“Z- Stack”界面，设定拍摄目标的上限和下限;调整拼图大小，点击开始实验进行采集。
4 常见问题分析
1）视野的一边出现暗区
查看Apotome是否完全插入，Apotome插入時听到“咯噔”声之后才是已经完全插入;检查物镜下方的黑色插片，出现视野有黑斑时可将插片拔出。
2）软件中仅显示了全视野的局部区域
“Locate””Acquisition”中相机的“Binning”是否为1×1;“Acquisition ROI”中的“Size”是否为最大（2752×2208）。
3）荧光灯亮，但是镜下是黑的看不到荧光
应首先排除样品问题，正常情况下，将相应通道的荧光强度调到20%即可看到荧光;查看二分镜是否旋转到对应的数字。
4）软件中已经选择了某荧光通道，且激光强度也已修改，但显微镜没有光亮。
查看观察方式是否已经改为镜下观察;TFT触摸屏上的“RL”是否是“On”的状态，“TL”是“Off”状态 （“RL”是反射光/荧光观察模式，“TL”是透射光观察），进行明场观察和微分干涉（DIC）观察。
5）微分干涉观察时，图片质量很差，细胞轮廓模糊不清
所用的培养容器是否是玻璃底的;所用物镜是否配置了DIC观察方式;确认物镜下方插槽内是否插入了匹配的DIC棱镜。
6）聚焦策略选用完美聚集时，仪器报错显示找不到样品位置
查看软件中完美聚焦是否已正常运行，将仪器和软件全部重新启动一次;转换一下其他镜头观察，排除镜头损坏或使用错误镜头导致的;所用的培养皿质量不合格，皿底厚度不一，导致折射率不同而不能运用完美聚焦功能。
5 维护和管理
1）所有使用者需提前在网上进行预约，经管理者审核通过后方可使用。为使仪器得到高效地使用，预约者不能按时进行实验的，需提前取消预约。未经培训者，不得擅自上机操作。
2）严格遵守仪器的操作规程，尤其是开关机流程，避免因操作不当造成仪器的损坏。实验过程中遇到报错现象，必须联系管理员或工程师，不得强行进行实验，避免造成不必要的损失。
3）进行玻片观察时，活细胞培养装置就不必打开。进行活细胞试验时，分别打开完美聚集，SMC2009（控制移动载物台），apotome插件（一个光切系统），显微镜控制器，活细胞培养控制器，显微镜和电脑，最后打开软件。使用细胞培养装置前要确认一下通气瓶内的水是否够加满，通气瓶内的水需是高压过的超纯水。
4）二氧化碳气瓶的开关，有两个气压表，右边的总阀的（一直开着），用的时候气压阀拧紧（拧紧是开）气压表指到0.1的时候不超过0.2正好。经常使用气瓶阀门不用关，长期不用必须将气瓶关掉防止漏气，以免造成二氧化碳的浪费。
5）打开软件时，需在验证通过后方可将样品放到显微镜上。
6）对于不常用的物镜，最好取下保存于物镜盒内，防止操作不当对其造成损坏或因长期不用不好打理。复消色差物镜移动的时候容易撞到六孔板的底部，拍照时只针对单孔，且仅观察载玻片或玻底皿样品。油镜使用后，擦镜纸蘸取酒精小心擦拭，防止损坏镜头。所有物镜定期用棉棒进行擦拭。实验结束后，将物镜调到最小倍数并降到最低。
7）荧光样品的观测，在上机前最好在自己实验室用普通荧光显微镜观察是否有荧光，细胞的状态是否良好。
8）进行活细胞观察时，需提前一小时将温度的控制器打开，防止热胀冷缩细胞会随着视野的移动而发生飘焦现象。软件的细胞培养栏中的“M”代表六孔板的底座，“P”代表培养皿的底座，观察六孔板时打开“P”，观察培养皿时打开“M”。开始活细胞荧光观察实验后，室内保持遮光环境，避免外源光影响实验结果。
9）光学部件对外界环境要求较高，定期对实验室进行除尘和净化，室内配有除湿机、空气净化器和空调，确保仪器环境良好。
10）实验结束后，做好仪器和室内的清洁工作。实验数据严禁用U盘/硬盘拷贝，可通过校内网盘上传或光盘刻录，避免系统感染病毒。
6 结语
高端精密仪器是保证、提高科研水平的必要条件，但设备管理员的专业素养，是保证设备的安全性、可靠性，降低运行成本，协助使用者得到最佳的实验数据，最终提高设备综合使用效益的前提条件。
参考文献
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