陆伟宏 卢惠萍 方琦
DOI：10.16661/j.cnki.1672-3791.2103-5042-3695
摘 要：臭氧是一种强氧化剂，相较于其他化学消毒剂具有显著的优点，在消毒领域日益受到重视而广泛应用。臭氧的制备方法有紫外线辐射法、电晕放电法、电解法，固态聚合物电解质（SPE）电解技术的快速发展让臭氧的使用变得更经济方便。臭氧对细菌、病毒、真菌、原虫有很强的杀灭能力，该文介绍了近期臭氧消毒方面的研究成果。不同的种属对臭氧的敏感性不同，针对具体的应用环境，应综合考虑各方面因素，以提高臭氧消毒的效能。
关键词：臭氧 消毒 細菌 病毒 真菌
中图分类号：TS201.3 文献标识码：A文章编号：1672-3791（2021）03（b）-0072-05
Research Progress in Ozone Disinfection
LU Weihong1 LU Huiping1 FANG Qi2
（1.Medical School of Jinhua Polytechnic， Jinhua， Zhejiang Province， 321007 China; 2.Jinhua Runda Environmental Protection Technology Co.， Ltd.， Jinhua， Zhejiang Province， 321000 China）
Abstract： Ozone is a strong oxidant， which has obvious advantages over other chemical disinfectants and is widely used in the field of disinfection. Ozone can be prepared by ultraviolet irradiation， electric corona discharge and electrolysis. With the rapid development of solid polymer electrolyte （SPE） electrolysis technology the use of ozone is becoming more economical and convenient. Ozone has prominent ability to inactivate bacteria， viruses， fungi and protozoa，and the recent research developments of ozone disinfection are introduced in this paper.The susceptibility of different species to ozone is different. Various factors of a certain application environment should be comprehensively considered to improve the efficacy of ozone disinfection.
Key Words： Ozone; Disinfection; Bacteria; Viruses; Fungi
臭氧是氧气的同素异形体，1840年由德国化学家Schonbein发现并命名。臭氧又称为超氧、三原子氧，化学式是O3，分子量47.998，是一种有鱼腥气味的淡蓝色气体。臭氧是一种高效的消毒剂，有很强的氧化性，在水中的氧化还原电位是2.07 V，氧化能力高于双氧水（1.98 V）、氯（1.36 V）和二氧化氯（1.50 V），仅次于氟;对病毒、细菌、真菌、原虫等有很强的灭活效果;臭氧在氧化消毒过程中转变成分子氧，不存在任何残留物，避免了其他消毒剂易引起二次污染的问题;在医疗卫生、食品果蔬保鲜、清洁饮用水等领域已广泛应用臭氧作为消毒技术手段。臭氧对微生物的杀灭主要机制是与细胞成分发生氧化反应，细胞膜中含有不饱和脂，脂中的双键被氧化后导致胞膜受损从而引起细胞内容物外泄和细胞裂解;细胞内有些酶和蛋白质含有半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，这些对臭氧敏感的氨基酸残基被氧化后致使酶变性失活、蛋白质失去正常功能。
1 臭氧的制备
在常温常压下臭氧的半衰期一般是20～40 min，稳定性较差，需要臭氧时通常采用现场制备[1]。产生臭氧的方法主要有紫外线辐射法（Ultraviolet irradition）、电晕放电法（Electric corona discharge）和电解法（Electrolysis）等[2]。
1.1 紫外线辐射法
利用波长小于200 nm的紫外线照射干燥的空气，其中一部分氧分子获得能量后被激活解离出氧原子，进而形成臭氧[3]。此法制备臭氧不需要复杂的转换设备，不易产生副产物，不足之处是得到的臭氧浓度低，不适于工业化生产和应用。实验室等密闭空间常采用臭氧和紫外线的协同作用进行消毒。
1.2 电晕放电法
在两个电极之间放置绝缘介质，并保持一定的放电间隙，当外加交流高压（约1 500 V）于两个电极时，均匀的蓝紫色电晕放电出现在放电间隙，当空气通过电晕放电区时，氧气被高速电子轰击继而分解出氧原子，相互碰撞后形成臭氧[4]。电晕放电法制备臭氧效率较高，可控性较好。但是采用空气作为原料气时，氮气在高压电击时与氧气发生反应形成二氧化氮等有毒物质造成环境污染;此方法还需要配置高压设备、干燥系统和冷却装置，不仅增加投资费用而且使设备体积过大不易移动和维修。故电晕放电法在有些消毒领域的应用受到了限制。
1.3 电解法
电解法产生臭氧的技术是利用低压直流电源对水进行电解，在阳极释出臭氧，在阴极释出氢气或者进行氧还原反应。电解法制备臭氧的装置相对轻便，主要含有电源、电解质和阴阳电极。阳极材料必须具有强抗腐蚀性、良好的导电性、较高的释氧电位，常用的材料有二氧化锡（SnO2）、玻璃碳、硼掺杂金刚石（BDD）和二氧化铅（PbO2）等。阴极材料要求不被电解液腐蚀和较低的析氢电位，例如不锈钢、镍、镀铂金属等。电解质是一些酸或盐类，如H2SO4、HClO4、NaPF6、Na2SO4等，溶于水后形成电解液。早期的电解法是采用电解液加入到电解槽中，电解面积小，臭氧产量低，运行费用高。
近年来，固态聚合物电解质（Solid polymer electrolyte，SPE） 电解技术快速发展起来。代替传统的液体电解质的SPE膜是一种离子交换膜，使用时只需将去离子水加入到SPE膜复合电极体中即可发生电解反应。SPE电解技术极大程度上的增加了电解反应的比表面积，电流效率高、能耗低、臭氧产量高、臭氧纯度高、不会产生氮氧化物等二次污染[5]。这些优势使SPE电解技术成为臭氧技术发展的新趋势，将具有巨大的市场潜力。
2 臭氧的消毒作用
2.1 氧对细菌的灭活作用
不同属和种的细菌对臭氧的敏感性有差异。陈梦曦等研究者[6]以鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为受试菌种进行定量杀菌试验，在消毒机箱内压强为50 kPa，臭氧浓度为8.33 mg/L的条件下消毒60 s后，3种菌的杀灭对数值分别为5.91、5.90、6.04。有的学者认为革兰氏阴性细菌相较于革兰氏阳性菌对臭氧更為敏感，但有些实验并不支持这个观点。Martinelli等[7]的一项研究报道臭氧对水中金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，灭活率为98.9%，对嗜肺军团菌、粪链球菌、铜绿假单胞菌的灭活率分别为87.5%、64.2%、57.4%，对大肠杆菌的灭活率仅为26.4%。
通常来说，对臭氧处理的抵抗力芽胞比营养细胞要强。Akbas等研究者[8]采用1.0 ppm的气态臭氧处理蜡样芽胞杆菌的营养细胞和芽胞，暴露相同时间后，营养细胞数量减少了3.5个对数单位，但芽胞数量只减少了2个对数单位。在另一项研究中，Ding等研究者[9]比较了5种细菌的营养细胞和3种细菌的芽胞对臭氧的抵抗力，发现营养细胞对臭氧的抗性均低于芽胞的抗性，其中抗性最强的是蜡样芽胞杆菌的芽胞。这些研究表明要达到同样的灭活效果，芽胞需要更高的臭氧浓度或更长的处理时间。
细菌存在的环境因素影响臭氧处理的灭活效果。Ofori等人[10]研究了4种有机溶剂乙醇、甲醇、乙酸乙酯和二甲基亚砜（DMSO）对臭氧灭活水中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的影响。在每种有机溶剂浓度分别为2.5%和5%时测定臭氧的吸收和分解率，并构建效率因子Hom模型描述失活动力学。结果表明，乙酸乙酯和二甲基亚砜提高了臭氧的稳定性，在这两种溶液中臭氧对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭活率，相较于在甲醇和乙醇溶液中增加了大约2倍。
臭氧暴露导致细菌死亡，然而细菌可能存在一些防御调控机制来缓和这种致死作用。粘质沙雷氏菌是一种机会性病原菌，Ondarza[11]研究了色素沉积和过氧化氢酶活性对此种菌在臭氧暴露时的存活率的影响。实验数据显示，指数生长期的菌株过氧化氢酶活性提高了，菌株的存活率也相应增加;而灵菌红素未能增加菌株的存活率。该结果提示过氧化氢酶可能是细菌减轻臭氧致死机制的一部分。Feng等研究者[12]研究的副溶血性弧菌实验也得到类似结论，臭氧溶液浓度小于0.125 mg/L时，副溶血性弧菌利用过氧化氢酶和超氧化物歧化酶来进行解毒，细胞膜保持完整;当臭氧浓度大于1 mg/L，透射电镜证实细胞膜出现损伤，臭氧水溶液通过渗漏的膜进入细胞，使酶失活DNA降解，最终导致细菌死亡。
2.2 臭氧对真菌的灭活作用
气态臭氧和臭氧水溶液是有效的抗真菌剂，对真菌的杀灭作用因物种而异。张丹等研究者[13]以黑曲霉孢子作为研究对象，调查发现用10 mg/L的臭氧水悬液作用黑曲霉孢子，处理时间达到3 min，孢子的灭活率为100%。刘焕军等研究者[14]从发病的猕猴桃中分离出扩展青霉菌和灰葡萄孢菌两种病原真菌，研究了臭氧对这两种真菌孢子萌发的影响;采用170 mg/m3的臭氧处理后，扩展青霉菌孢子的抑制率为58.5%，灰葡萄孢菌孢子的抑制率为73%。
真菌包括单细胞的酵母菌和丝状的霉菌，胡林凤等研究者[15]调查了4种酵母菌在不同浓度和作用时间下对气态臭氧的敏感性。当用240 mg/m3的臭氧处理15 min，白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌的灭活率分别为28.25%、41.6%、44.89%、52%;如果保持臭氧浓度不变，处理时间延长为45 min，则灭活率都显著提高，分别是66.57%、88.91%、78.66%、84.86%;当时间仍为45 min，臭氧浓度增为2 736 mg/m3，这4种念珠菌的灭活率均达到100%。数据表明随着臭氧浓度和处理时间的增加，臭氧的杀灭真菌能力增强。
基因的甲基化程度提高会降低甚至关闭基因的表达，可能导致菌株不能存活。Gryzinska等研究者[16]分析了臭氧处理对白色念珠菌核酸甲基化的影响。结果显示，臭氧具有显著的作用，总的DNA甲基化的程度取决于白色念珠菌暴露在臭氧中的时间长短，长时间暴露可大量地提高DNA甲基化水平。另一项研究中，Woloshuk等研究者[17]也探查了臭氧引起的基因表达改变，将黄曲霉置于亚致死剂量的臭氧中培养3 d，之后转移到无臭氧环境中继续培养，从去除臭氧后0、4、12、24 h的培养物分离出总RNA，将此总RNA与含有代表14 163个黄曲霉基因探针的芯片进行杂交。表达谱表明，经臭氧处理的培养物中，疏水蛋白基因和产孢基因的转录显著降低;但也有少数基因的表达显著上调，其中一个是CAT5，它是黄曲霉中5个可能的过氧化氢酶基因之一，在将臭氧处理的培养物转移到空气环境后4 h内，CAT5的表达即降低到对照水平。若将空气中生长的黄曲霉转移到臭氧环境中培养，CAT5的表达则在4 h后增加了3倍。
2.3 臭氧对病毒的灭活作用
病毒按侵染对象不同可分为噬菌体、植物病毒、脊椎动物病毒、昆虫病毒等，有些病毒对人类健康构成威胁，而臭氧是一种有效的病毒灭活剂。诺如病毒可引起人类急性胃肠炎，Shin等研究者[18]采用浓度为0.37 mg/L的臭氧溶液处理诺如病毒，10 s后该病毒被灭活大于3个对数单位;在另一项研究中Brié等研究者[19]也得到类似结果，将吸附在树莓上的小鼠诺如病毒暴露于3 ppm的气态臭氧中，1 min后导致此病毒大于3.3个对数单位的灭活。Petry等研究者[20]报告了将单纯疱疹病毒1（HSV-1）和牛疱疹病毒1（BoHV-1）暴露于臭氧中3 h，两者的滴度下降分别为90.0%和99.62%。
不同种类的病毒对臭氧的敏感性不同。Wolf等研究者[21]测试了5种肠道病毒和4种噬菌体，分别是柯萨奇病毒B5（CVF、CVEnv1和CVEnv2）、人腺病毒（HadV）、埃可病毒11（EV）、噬菌体（MS2、Qβ、T4和 Φ174），建立起一个批处理系统可定量描述臭氧暴露与病毒灭活的关系。所测病毒的二阶臭氧灭活速率常数在4.5×105～3.3×106 mol/l s之间。这些病毒中Qβ对臭氧最敏感，敏感顺序依次为Qβ>CVEnv2>EV≈MS2>Φ174≈T4>HAdV>CVF≈CVEnv1。
一些学者对臭氧灭活病毒的机理进行了分析研究。Jiang等研究者[22]采用细胞培养、长重叠RT-PCR和斑点杂交等方法，探讨臭氧诱导脊髓灰质炎病毒1型（PV1）失活的机制。结果表明，臭氧主要通過破坏PV1基因组的5'-非编码区（5'-NCR）使PV1失活，臭氧对5'-NCR的80～124核苷酸（nt）区域有特异性的损伤;重组病毒基因组RNA感染模型证实缺少该区域的PV1是非传染性的。Tizaoui[23]通过分子建模评估SARS-CoV-2病毒结构中具有代表性的关键分子对臭氧的反应性，建模显示臭氧能攻击病毒包膜刺突上的蛋白质和脂类，特别是针对色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸，以及花生四烯酸、亚油酸和油酸;从建模结果推断臭氧可能起到灭活SARS-CoV-2的作用。
2.4 臭氧对原虫的灭活作用
原虫为单细胞真核动物，广泛分布于海洋、土壤、水体或腐败物内，有一些寄生的原虫对人体有害，例如溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫等通过水源或食物传播引起疾病流行爆发。臭氧的氧化性高于氯、二氧化氯、氯胺，是一种更有效的灭活原虫寄生虫的消毒剂。王尚等研究者[24]采用DAPI和PI荧光活体染色法对臭氧灭活水中微小隐孢子虫卵囊的效果进行了研究。结果显示，臭氧浓度为0.3 mg/L处理60 min，灭活率为99.81%，若将浓度提高到3 mg/L，达到99.99%的灭活率只需10 min，此外温度、色度、pH对灭活效果也有一定的影响。另一项研究中，Ran等研究者的研究中也报道了相似的测试数据，浓度高于3 mg/L的臭氧处理隐孢子虫7 min可获得显著的灭活效果;同时通过扫描电镜观察隐孢子虫细胞超微结构的变化，未接触臭氧的细胞呈圆球形，接触臭氧60 s时细胞折起内陷，接触480 s时隐孢子虫细胞膜完全皱缩、塌陷、爆裂[25]。
原虫的包囊有较厚的壁，抗逆性强，因而能在外界环境中存活较长时间，例如蓝氏贾第鞭毛虫的包囊在水中和凉爽环境中可存活数天至1个月之久。Nakada等研究者[26]的研究显示了较低浓度的臭氧（5 mg/L）并不能完全灭活水中的贾第虫包囊。而Boland-Nazar等研究者[27]检测了臭氧对橄榄油中的贾第虫包囊灭活情况，将橄榄油中臭氧浓度调整为32、64、96、128、160 mg/g，经过一段时间处理后此5个浓度的臭氧均导致贾第虫包囊100%的死亡率，但达到这个死亡率的时间是有显著差异的。Hikai等研究者[28]报道臭氧是有效的消毒剂，能杀死棘阿米巴的包囊，可将臭氧用于牙科中相关水管的污染控制。
3 臭氧消毒的应用展望
随着臭氧制备技术的快速进展，臭氧作为一种化学消毒剂具有低经济成本、使用方便、作用快速、刺激性低、环保无残留污染等特点。臭氧的消毒效果受pH值、温度、湿度、作用时间等多种因素的影响，当介质中有机物含量很低时，对微生物和原虫的灭活能力主要取决于臭氧浓度。臭氧已广泛应用于水消毒（饮用水、游泳池、污水）、空气消毒、食品贮藏保鲜、抗感染治疗等方面。目前尚有一些问题亟待解决，例如：臭氧在杀灭食品上的病原生物时如何减少与食品成分相互作用，抗感染治疗中如何避免臭氧对人体正常组织细胞的损伤。因此，针对不同的应用场景，探索合适的臭氧消毒技术方法还需进一步研究。
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