郭善军 陈章宝
摘 要：目的 建立能准确测定木瓜超氧化物岐化酶（SOD）活性的测定方法。方法 采用单因素试验分析法，通过探究邻苯三酚自氧化反应体系的最大吸收波长、测定时间段、缓冲液pH值、邻苯三酚浓度和反应温度对自氧化速率的影响，建立了测定木瓜SOD活性的邻苯三酚自氧化法最佳应用体系;通过建立的木瓜SOD活性检测方法优化木瓜SOD提取条件。结果 邻苯三酚自氧化法最佳测定条件为：检测波长319nm，测定时间范围3.5min，缓冲液pH8.20，反应温度25℃，邻苯三酚浓度4.5mmol/L。木瓜SOD最佳提取工艺为：pH6.8的磷酸盐缓冲液、超声功率600W、超声时间20min浸提木瓜SOD，丙酮分级沉淀法纯化木瓜中的SOD，最终所得SOD用邻苯三酚自氧化法测定活性为529.72U/mg。结论 建立了能准确测定木瓜SOD活性的检测方法，并筛选得到木瓜最佳SOD提取条件。
关键词：超氧化物岐化酶 邻苯三酚自氧化法 提取方法优化
中图分类号：TS20 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2020）06（c）-0066-03
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称SOD）是一种广泛存在于自然界各种生物体内的酸性蛋白，自从1969年，超氧化物岐化酶首次被Fridovich和McCord[1]从牛红细胞中分离出来，发现其是一种重要的自由基清除剂，对治疗因超氧游离基引起的各种疾病都有一定的疗效，临床可作为抗老化、抗炎症、自身免疫疾病的治疗药品。
1 材料和方法
1.1 材料
鲜木瓜购买于重庆市綦江县三角镇木瓜海棠园。
1.2 方法
1.2.1 邻苯三酚自氧化法的建立
具体情况见表1。
1.2.2 影响SOD活性测定的因素
将质量浓度为258μg/mL SOD标准液，分别于37℃、60℃、100℃条件下，加热处理0min、3min、5min、20min、60min，边加热边用玻璃棒轻轻搅拌，加热完成后，迅速放入冰水混合物中冷却30min，然后分别取不同温度下各时间段的SOD溶液，加入到SOD检测体系中进行测定。
1.2.3 SOD提取及其工艺优化
（1）称取20g的新鲜木瓜，用榨汁机使其组织破碎，加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液40mL，搅拌浸提过夜，用纱布滤去粗大的纤维物质，5000rpm，4℃，离心10min，去除多糖和其他不溶杂质。
（2）粗提液于0℃低温循环水溶超声处理，辅助木瓜SOD提取，5000rpm，4℃，离心10min得到提取液。
（3）提取液中加入10mL氯仿-乙醇（V氯仿∶V乙醇=3∶5）混合液作为萃取剂，搅拌过夜，5000rpm，4℃，离心10min，取上清，得粗酶液。
（4）将所得粗酶液于60℃恒温水浴热击20min除杂蛋白，立即流水浴冷却至室温，5000rpm，4℃，离心20min，除去沉淀杂蛋白。
（5）采用硫酸铵盐析法，向（4）中所得上清液中加入（NH4）2SO4至45%饱和浓度，搅拌过夜后，5000rpm，4℃，離心20min;取上清加入（NH4）2SO4至90%饱和度，搅拌过夜后，5000rpm，4℃，离心20min得到沉淀，0.2mol/L磷酸盐缓冲液溶解，透析24h，取样加入到SOD检测体系中进行测定。
2 结果与分析
2.1 邻苯三酚自氧化法的建立
2.1.1 邻苯三酚自氧化最大吸收波长的选取
由图1可以看出，4min内邻苯三酚自氧化产物的最大吸收峰为319nm，而在325nm、420nm处基本无吸收峰出现。与文献报道的最大吸收峰420nm和325nm有一定差异。因峰的灵敏度和准确度，该试验选择波长319nm进行测定。
2.1.2 邻苯三酚自氧化测定时间范围的选取
如图2所示，为了准确测定邻苯三酚自氧化速率，该试验选取30～210s即3min时间段内直线斜率来表示邻苯三酚的自氧化速率△A0。
2.1.3 pH对邻苯三酚自氧化速率的影响
如图3所示，邻苯三酚自氧化速率在碱性条件下随pH的升高而增大，并且斜率逐渐增大，这可能与pH增大时邻苯三酚的酚羟基中H+更易解离，形成的带电基团能量较高、不稳定，而易被氧化有关。因此，综合考虑诸因素的影响，该试验选择pH8.2作为缓冲溶液适宜的pH值。
2.1.4 邻苯三酚浓度对自氧化速率的影响
如图4所示，邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增大，两者呈线性关系，且邻苯三酚自氧化进程的吸光度值与时间的线性关系，随其浓度的升高而降低。因此，该试验选用邻苯三酚的浓度为4.5mmol/L。
2.2 影响SOD活性测定的因素分析
2.2.1 SOD活性测定范围的选择
邻苯三酚自氧化抑制率在15%～60%之间时，SOD浓度与自氧化抑制率间基本呈正比关系。因此，测定样品SOD活性时，调节样品浓度，选取百分抑制率在50%左右的样品浓度，此时测定的准确度和灵敏度最佳。
2.2.2 SOD热稳定性试验
由图5可知，标准SOD在37℃和60℃下加热1h，SOD活性略有降低，但总体变化不大，说明SOD活性在37℃～60℃范围内比较稳定。而SOD标准品在100℃下加热失活后，依然能够检测出SOD活力，且活力在1h时反向增大，说明失活的SOD蛋白对检测体系仍会造成干扰。因此，该试验选择在60℃水浴20min，加热去除杂蛋白。
2.2.3 维生素C对SOD检测体系的影响
从表2结果说明，维生素C是对SOD检测体系构成干扰的小分子物质，木瓜中含有较多的维生素C可影响SOD活性的检测。因此，该试验后续将通过透析24h，排除VC对SOD检测体系造成的影响。
2.3 木瓜SOD提取工艺优化
2.3.1 提取溶剂的筛选
从表3可以看出，pH6.8磷酸盐缓冲液的提取液酶活性最高。因此，pH6.8的磷酸盐缓冲液提取木瓜SOD提取效果最好。
2.3.2 超声萃取功率的筛选
由超声功率筛选结果可知（见表4），随着超声功率的提高，木瓜SOD提取率明显增加。但超声功率过高，SOD活性反而有所下降。这可能是由于超声功率过高引起了酶蛋白的空间结构发生变化。综合考虑，该试验选择600W超声功率为SOD提取的最佳功率。
2.3.3 木瓜中SOD的提取
木瓜通过提取纯化后，采用邻苯三酚自氧化法测定木瓜中SOD活性分别为529.72U/mgprot，说明筛选得到的木瓜SOD提取条件稳定、可行。
3 结语
该试验采用单因素试验分析法探究邻苯三酚自氧化反应体系的检测条件，建立了邻苯三酚自氧化法最佳应用体系。试验证明，该体系测定结果稳定且准确。利用建立的邻苯三酚自氧化法筛选木瓜SOD最佳提取条件的筛选，得到木瓜SOD提取的最佳条件，为将来开发利用木瓜内SOD提供了基础。
参考文献
[1] McCord J，Waugh TA，Ritchie J M. Overexpression of manganese or copperzinc superzinc superoxide dismutase inhibits breast cancer growth[J].Free Radic Biol Med，2006，419（2）：226-237.
[2] 金紹黑.植物超氧化物歧化酶的提取、修饰制备工艺及其应用研究[J].成都航空职燃学院学报，2005，21（1）：44.
[3] 许雅娟，赵艳景，胡虹.邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究[J].西南民族大学学报：自然科学版，2006，32（6）：1208-1212.
