彭煜策 赵梅 吴淑菲 江玲 杨俊宝
摘 要：该文以南充产半夏的干燥块茎为研究对象，采用植物活性蛋白质提取试剂盒提取其总蛋白，通过用考马斯亮蓝快速染色法测定蛋白质浓度，然后用12%的SDS-PAGE变性胶分析南充产半夏的蛋白质组分，再用蛋白质质谱仪测定半夏蛋白质的类型和分子量， 结果得到南充产半夏特有的两种约22kD和15kD的含量较高的蛋白质组分，且发现暂未被相应数据库收录。这为南充产半夏组分的类型与功效的进一步研究奠定了基础。
关键词：半夏 总蛋白 蛋白质谱鉴定
中图分类号：R282.7 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2018）06（c）-0223-03
半夏Pinellia ternata（Thunb）Breit具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效，有报道其蛋白质有诱导人肝癌细胞Bel-7402凋亡的作用[1]，半夏蛋白的种类和含量的差异可能是半夏品质的一个评判标准。南充是川产道地药材川半夏的主产区，南充产半夏的药用历史悠久，国内外驰名，商品成类球形、个大、粉性足[2]。本研究拟用试剂盒提取南充产半夏块茎的总蛋白质，用考马斯亮蓝快速染色法测定蛋白质的浓度，然后用12%的SDS-PAGE变性胶分析半夏蛋白质的组分，同时用蛋白质谱仪测定蛋白质的类型和分子量，为南充产半夏组分的类型与功效的进一步研究奠定基础。
1 材料与试剂
1.1 材料
半夏鲜品采自四川南充， 洗净后经川北医学院生物学教研室鉴定为正品，然后烘干备用。
1.2 试剂
过硫酸铵（APS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、溴酚蓝、N，N-甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、一步法植物活性蛋白质提取试剂盒购于生工生物工程（上海）有限公司；蛋白Marker、考马斯亮蓝快速染色液购于北京天根公司；实验用化学药品均为分析纯。
蛋白质谱鉴定委托杭州景杰生物科技有限公司进行，所用试剂由该公司提供。
2 实验方法
2.1 半夏总蛋白的提取
利用上海生工的“一步法植物活性蛋白质提取试剂盒”提取半夏总蛋白。称取20mg干燥的半夏块茎，用研磨棒研磨成粉末，然后将粉末全部转移到1.5mL的离心管中。加入1mL的蛋白提取混合液，用研磨棒进行研磨，直到看不见明显的块茎团块。然后将混合液涡旋震荡2min，再4℃，8000rpm离心5min，使有机相和水相分层。最后将枪头小心伸入到下层水相中，将含有半夏蛋白的下层水相吸出，转移到一个新的1.5mL的离心管中，此下层水相中即含有半夏的可溶性蛋白，保存备用。
2.2 半夏蛋白的SDS-PAGE電泳和考马斯亮蓝染色
取10μL提取的半夏总蛋白液，加入2l 5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液缓慢混匀，金属浴加热5min，冰浴备用。将准备好的蛋白样品上样到12% SDS-PAGE变性胶的加样孔内，先50V电泳25min，等样品全部进入分离胶以后80V 电泳60min。电泳结束后，将PAGE胶取下放入合适的容器中，加入50mL双蒸水没过胶面，加热至沸腾后停止，在脱色摇床上摇动5min，弃去水溶液。加入25mL考马斯亮蓝快速染色液，以浸没胶面为准，加热至沸腾后保持沸腾状态60sec，停止加热，在脱色摇床上继续摇动5min，弃去染色液。然后加入约50mL双蒸水，加热至沸腾后保持沸腾状态30sec，停止加热后继续在脱色摇床上摇动8min，换水即完成脱色，观察结果。
2.3 半夏蛋白的质谱仪测定
另将半夏总蛋白按上述SDS-PAGE电泳方法，待样品全部进入浓缩胶即停止电泳，切下含半夏总蛋白的胶块送杭州景杰生物科技有限公司进行蛋白质谱鉴定，操作方法如下所述。
2.3.1 胶内酶解
将含有半夏总蛋白的胶条切碎，使用含50mmol/L碳酸氢铵（NH4HCO3）的50%乙腈（acetonitrile）进行脱色。然后用100%的乙腈共同孵育5min以便将胶块进行脱水，然后弃去体系中的液相，再加入终浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇（dithiothreitol）溶液，37℃孵育60min。再次使用100%乙腈孵育脱水，移去液相后加入终浓度为55mmol/L的碘代乙酰胺（iodoacetamide），室温避光孵育45min。之后使用终浓度为50mmol/L的碳酸氢铵清洗，再次使用100%乙腈孵育脱水。最后使用含有10ng/μL胰蛋白酶的50mmol/L碳酸氢铵重悬胶块，冰上孵育1h。除去样品中多余的溶液后，将胶块在37℃酶解过夜。酶解后的肽段依次使用50%乙腈/5%甲酸和100%乙腈提取出胶块，肽段溶液冷冻旋干后备用。
2.3.2 液相色谱-质谱联用分析参数设置
肽段用含0.1%甲酸和2%乙腈的流动相A溶解后，经EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相B为含0.1%甲酸和98%乙腈的水溶液。液相梯度设置：15min25% B相；23min70%B相；28min80%B相，流速维持在800nL/min。
通过超高效液相系统分离后的肽段被注入到NSI离子源中进行电离，然后用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus质谱对肽段进行分析。离子源的电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350～1800m/z，扫描分辨率设置为70，000；Orbitrap扫描分辨率设置为17，500。数据采集模式使用数据依赖型扫描（DDA）程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20个肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28%的破碎能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制（AGC）设置为5E4，信号阈值设置为5000ions/s，最大注入时间设置为200ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为15秒以减少母离子的重复扫描。
2.4 数据搜库
将得到的二级质谱数据使用Proteome Discoverer 1.3进行检索。检索参数设置如下：数据库设置为UniProt Pinellia ternata （180条序列）；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设置为2；一级母离子质量误差容忍度设置为10ppm；二级碎片离子的质量误差容忍度设置为0.02Da；固定修饰设置为半胱氨酸烷基化；可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化和蛋白N端的乙酰化；肽段离子打分要求高于20，鉴定结果peptide confidence设置为High。
3 结果与讨论
3.1 半夏总蛋白的SDS-PAGE分析结果
将南充产半夏的总蛋白用12%SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮蓝染色分析蛋白质组分，得到两种约22kD和15kD的含量较高的蛋白质组分（见图1）。
3.2 半夏总蛋白的质谱分析结果
本实验结合胶内酶解和高分辨生物质谱技术，对胶条样品中的蛋白混合物进行分析，对半夏总蛋白样品共鉴定到30个肽段，最终鉴定到7个蛋白，鉴定结果见表1。
3.3 讨论
半夏的干燥块茎具有非常高的药用价值，其主要含有生物碱、半夏蛋白、β-谷甾醇、氨基酸、多糖、挥发油及无机元素等多种成分，在这些化学成分中，半夏蛋白是抑菌、抗肿瘤和抗早孕等药理作用的主要有效成分[3]。已有研究证实半夏凝集素是半夏蛋白的主要成分之一，其基因已被克隆，蛋白大小为29KD[4]。但是在半夏蛋白的提取过程中，鲜、干材料对半夏蛋白提取的质量浓度有不同的影响[3]，这也是在本实验中进行染色时一些蛋白条带浓度很低的原因。
本研究利用一步法植物蛋白提取试剂盒成功地提取了南充产半夏的总蛋白质，通过用考马斯亮蓝快速染色法测定了半夏蛋白质的浓度，然后用12%的SDS-PAGE变性胶分析蛋白质组分大小和纯度，最后委托杭州景杰生物公司用蛋白质谱仪进行蛋白质质谱鉴定。质谱数据根据已知数据库的搜索结果显示，共鉴定出其中的7种已知蛋白，但含量丰富的约22kD和15kD的兩种蛋白质组分没有被鉴定出来。有研究证实，产于不同地方的半夏及半夏的混伪品中各自总蛋白的含量有比较明显的差异[5]，这提示本研究中未鉴定出的这两种组分可能是南充半夏具有的特异蛋白质，亦或是序列结构不清楚的两种新蛋白，其性质与功效有待进一步深入地研究。
参考文献
[1]黄必胜.半夏蛋白对人肝癌细胞Bel-7402的诱导凋亡作用[J].时珍国医国药，2007，18（5）：1056-1057.
[2]白权，李敏，贾敏如，等.南充半夏野生资源调查及品质鉴定[J].川北医学院学报，2000，15（4）：47-48.
[3]张小团，严静，高鸿，等.半夏蛋白的提取工艺及其凝集素的抑菌研究[J].西南师范大学学报：自然科学版，2015，40（6）：43-48.
[4]赵欢，彭正松，雷杨，等.半夏凝集素基因的克隆、生物信息学分析及其蛋白的亚细胞定位[J].中草药，2014，45（13）：1914-1919.
[5]曹艳，黄必胜.半夏总蛋白含量的紫外吸收法测定[J].湖北中医杂志，2005，27（7）：48.
