郑选梅 李成华 刘洲 林智君
摘 要：目的 探讨螺旋藻多糖对阿尔茨海默病模型小鼠同型半胱氨酸水平的影响。方法 实验小鼠腹腔注射亚硝酸钠100mg/kg和D-半乳糖120mg/kg制备阿尔茨海默病模型。将动物小鼠随机分为模型组（A组）、实验组（3个剂量浓度B1、Bm、Bh）及正常组（C组），每组8只，实验组分别给予螺旋藻多糖灌胃低剂量、中剂量、高剂量（6.7mg/kg·d-1、67mg/kg·d-1、134.0mg/kg·d-1），连续8周，第9周时，采用Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力后取脑部组织匀浆，测同型半胱氨酸（Hcy）、丙二醛（MDA）水平。结果 与A组相比：C组、Bm组、Bh组120s内跨越平台的次数和在目标象限的探索时间均差异有统计学意义（P<0.05）;C组、Bm组、Bh组Hcy水平含量减少，差异有统计学意义（P<0.05）;C组、Bh组MDA差异有统计学意义（P<0.05）。结论 螺旋藻多糖可能会降低D-半乳糖联合亚硝酸钠诱导的AD模型小鼠脑组织Hcy水平含量，而且中、高剂量灌胃的效果好，可为今后的实验设计提供理论依据。
关键词：螺旋藻多糖 小鼠 同型半胱氨酸 阿尔茨海默病
中图分类号：R91 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2020）08（a）-0196-04
Effects of Spirulina on the Level of Homocysteine with Alzheimer Disease Model Mice
ZHENG Xuanmei1 Li Chenghua2 LIU Zhou3 LIN Zhijun3
（1.Lingnan Normal College， Zhanjiang， Guangdong Province， 524048 China; 2. Guangdong Maternal and Child Health Hospital， Guangzhou， Guangdong Province， 514000 China; 3.Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong Province， 524000 China）
Abstract： Objective To explore the effect of spirulina on the level of homocysteine mice with Alzheimer's disease model. Methods The AD model was prepared by injection of D-galactose 120mg/kg and sodiumnitrite 100mg/kg. 40 mice were randomly divided into normal group （C） group， model group （A）， and 3 dose group（B1、Bm、Bh）， each group of 8， they were given spiral alga of lavage low dose group （Bl） of 6.7mg/kg·d-1， high dose group （Bh） of 134.0mg/kg·d-1， eight weeks in a row， after 9 weeks， using Morris water maze test of learning and memory ability in mice after measuring serum homocysteine （Hcy） and malondialdehyde.Results Compared with group A， the number of trips across the platform in group C， Bm and Bh group 120s and the exploration time in the target quadrant were statistically significant（P<0.05）; The levels of Hcy in group C， group Bm and group Bh decreased， the difference was statistically significant （P<0.05）， MDA in C group and Bh group was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Spirulin may reduce levels of Hcy of D - galactose joint AD model mice. Medium and high dose lavage effect is good， to provide a theoretical basis for future design of experiment.
Key Words： Spiraceous polysaccharide; Mice; Homocysteine; Alzheimer's disease
流行病學调查显示阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）患者日益增多，具体发病原因不明[1]，是一种以痴呆为主的大脑退行性病变。研究表明同型半胱氨酸（Hcy）与动脉粥样硬化、心血管病、脑梗死相关[2]，深静脉血栓的独立危险因素，但与AD的关系尚不完全清楚，高浓度的同型半胱氨酸（Hcy）可能对神经具有一定的毒性作用，对神经细胞也有一定的损伤作用[3]。大量的研究已证实抗氧化药物能提高大脑高级认知功能减少脑功能损伤[4]，延缓AD的病情。研究发现，作为海藻类生物螺旋藻多糖螺旋藻多糖分子中含有大量的糖醛酸、酚羟基等基团[5]，具有抗氧化作用、清除自由基的活性[6]，抗病毒活性，免疫机能的调节，在抗肿瘤，抗疲劳，抗衰老等方面均有着重要作用。其中，螺旋藻的提取物螺旋藻多糖（PSP）对Hcy的影响目前有关研究较为鲜见，为此，该文通过灌胃AD模型小鼠不同浓度的螺旋藻多糖，以观察螺旋藻多糖对小鼠脑组织Hcy水平及其相关指标是否存在剂量关系，旨在探讨螺旋藻多糖能否通过降低Hcy的水平来发挥其预防或治疗AD作用，以期为进一步研究螺旋藻多糖对AD的预防或治疗提供一定依据。
1 实验方法
1.1 实验动物分组与造模
SPF级昆明雄性小鼠，4周龄，体重（39.1±3.3）g，购自广东医科大学实验动物中心提供，适应性饲养3d。然后将40只实验小鼠随机分5组，每组均8只分别是：正常组（C）、模型组（A）以及3个实验组低、中、高剂量（B1、Bm、Bh）。模型组、实验组小鼠每天腹腔注射D-半乳糖120mg/kg联合亚硝酸钠100mg/kg，连续注射8周，制备阿尔茨海默病小鼠模型。
1.2 螺旋藻多糖提取
将螺旋藻干粉冻融、破壁、抽提取后沉淀离心取上清夜，采用三氯乙酸沉淀将上清夜去蛋白，用无水乙醇析出多糖淀，然后用有机溶剂洗涤沉淀物，得螺旋藻多糖粉剂（真空干燥）[7、8]。正常组A（给予腹腔注射同体积生理盐水），模型组C（ 灌胃同体积生理盐水） 和实验组（B1、Bm、Bh）剂量（灌胃同体积的螺旋藻多糖溶液（6.7mg/kg·d-1、67.0mg/kg·d-1、134.0mg/kg·d-1），于造模当天的同一时间段开始灌胃给药，连续8周（Bh组实验中死1只）。
1.3 行为学实验
在实验的第9周开始，采用Morris水迷宫方法测试各组小鼠行为能力。从4个标记的入水点依次朝向池壁将小鼠放入水中记录小鼠寻找平台所用时间（≤120s），就是小鼠逃避潜伏期时间。然后拆除平台，将小鼠放入水池中，记录小鼠在规定时间内（120s）在穿越平台的次数。
1.4 指标测试
实验结束第2天，小鼠被腹腔注射麻醉后，断头，取脑部组织，低温匀浆，测出实验小鼠的脑组织Hcy，MDA浓度。
1.5 统计学分析
所有的数据处理均采用SPSS 19.0统计分析，数据均数±标准差（χ±s）表示，采用单因素方差分析进行多组比较，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 实验结果
2.1 小鼠一般状态观察
正常组、实验组小鼠毛发有光泽，好动;模型组小鼠毛发稀疏变黄，少动、行动缓慢;实验组的状态小鼠总体上优于模型组。
2.2 小鼠Morris水迷宫测试结果
与A组比较，C、Bm、Bh组的潜伏期显著缩短（P< 0.05）;Bm、组跨越平台次数显著增多，Bh组甚至逼近C组（P<0.05），Bl组没有统计学差异。具体见表1。
2.3 各组小鼠脑部组织Hcy与MDA水平比较
与A组比较，C、Bl、Bm、Bh组均有低于A组趋势，与A组相比，除Bl组外，其他3组统计学均有显著性差异p<0.05。具体见表2。
3 讨论与分析
螺旋藻多糖（PSP）是螺旋藻的主要生物活性成分之一，从螺旋藻提取出的生理活性多糖。PSP可以参与细胞的活性调节，因而它具有抗辐射、抗氧化、抗疲劳、增强免疫力等生物学活性[9]，同时也被证明是一种无毒、无公害的天然提取物，被证明具有很强的抗氧化性能，能延缓植物组织氧化衰老，并保持甚至提高生物组织相关指标的水平[10]。另外，该实验团队之前的实验结果可知，8周螺旋藻多糖后灌胃干预，可提高AD小鼠的认知功能[11]，Hcy与AD的精神状况量表MMSE 评分呈负相关出现[12]，高浓度Hcy是AD的主要危险因素，跑台运动、叶酸和银杏叶片等干预可降低Hcy浓度水平[13，14]。
该实验对8周的螺旋藻多糖灌胃后，发现造模组小鼠均出现皮毛发黄缺乏光泽且目光呆滞进食与粪便均整体呈现出代谢变缓的迹象，而且采用Morris水迷宫进行实验测试，C、Bl、Bm、Bh组较A组小鼠其逃避潜伏期明显缩短以及跨越平臺次数明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），模型组的认知能力和学习能力均下降，与前人的研究结果基本一致，因此认为该实验的建模成功。同时也表明了螺旋藻多糖可以改善AD小鼠的脑部功能。
神经元丧失、淀粉样血管病变、神经毒性、神经原纤维缠结均为AD的主要病理学特征。研究结果表明Hcy的浓度在AD发病之前就已升高，提示Hcy可能成为预防阿尔茨海默病发生和发展的一个重要医学检验标志物。可能原因是Hcy能激活体内某种受体从而导致氧自由基的产生并累积造成钙离子超载，导致对神经细胞产生毒性作用，使海马部神经元的DNA修复功能受到损害，诱导其发生凋亡。该实验中A组Hcy、MDA浓度均高于C组，经过连续8周的螺旋藻多糖后除Bl组外，Bm、Bh组与A组比较，均有统计学差异（P<0.05）。由此可见，PSP可以降低小鼠脑组织Hcy、MDA的浓度，从而阻止或减慢AD的发病进程。螺旋藻多糖是从螺旋藻中提取的多糖类化合物，李羚等人[15]研究了螺旋藻及螺旋藻多糖体外清除OH、O2-的作用的实验，证实螺旋藻多糖能有效清除OH、O2-对脂质过氧化及DNA的OH氧化损伤有显著抑制作用，与此次实验研究结果一致。Tobon等人[16]观察螺旋藻对6-羟多巴胺（6-OHDA）致大鼠纹状体毒性影响，认为螺旋藻能够对抗（6-OHDA）致自由基升高引起的神经毒性从而保护体内多巴胺神经传递。因此一致认为老年性痴呆的病情严重程度和Hcy的浓度有着一定的相关性[17]，螺旋藻多糖有可能通过降低Hcy的浓度，达到减缓甚至治疗AD的效果。除了螺旋藻多糖本身具有强大的抗氧化性以外，推测另一个可能降低AD模型小鼠脑组织Hcy水平原因是螺旋藻多糖能提高体内叶酸、维生素B12等代谢酶的活性减轻Hcy对脑的损害[18] 。
另外，从此实验结果看出，服用中、高剂量的螺旋藻多糖的小鼠认知能力、Hcy、MDA水平较低剂量组均有显著提高，为今后研制开发螺旋藻多糖提供科学的依据。因此，螺旋藻作为含有多种生物活性的海洋生物产品，极具开发及研究潜力。
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