陈娴+刁玉华+肖丽恒
摘 要：建立測定云南小粒咖啡豆中咖啡因含量的HPLC方法，采用高效液相色谱仪带紫外检测器，使用C18柱（粒径：5 μm，3.9 mm×150 mm）；流动相：甲醇+水（24+76）；流速：1.0 mL/min；紫外检测器：检测器波长272 nm；柱温：25 ℃；进样量10 μL作为分析条件。咖啡因在0～200 ug/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；回收率均在90%～110%之间；检出限为0.125 mg/kg。结论 该法具有准确、灵敏、重复性好等优点，适合饮料中的咖啡因含量的检测。
关键词：液相色谱法 测定 云南小粒咖啡豆 咖啡因
中图分类号：O652.1 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）07（a）-0126-02
咖啡因：（Caffeine）是咖啡果中含有的一种生物碱，适度使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，虽然其成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重，但由于药物的耐受性而导致用药量不断增加时，咖啡因就不仅作用于大脑皮层，还能直接兴奋延髓，引起阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝、胃、肾等重要内脏器官，诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤等疾病，甚至导致吸食者下一代智能低下，肢体畸形。因此也被列入受国家管制的精神药品范围。滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。咖啡因主要用于对抗中枢抑制状态，如严重传染病、镇静催眠药过量引起的昏睡及呼吸循环抑制等，可肌肉注射苯甲酸钠咖啡因。此外，咖啡因还常配伍麦角胺治疗偏头痛：配伍解热镇痛药治疗一般性头痛[1]。此时，它由于收缩脑血管，减少脑血管搏动的幅度而加强以上药物止头痛的作用。目前对于咖啡因测定的方法主要有：滴定法[2]、紫外可见分光光度计法[3]、高效液相色谱法[4]、气相色谱法[5]、薄层色谱法[6]、毛细管电泳法[7]等方法。文章采用高效液相色谱的方法测定咖啡因，建立了采用高效液相色谱的方法测定云南小粒咖啡豆中咖啡因的方法，试验表明该方法前处理简单，分离效能好，回收率高，可以快速、简便、准确地检测云南小粒咖啡豆中的咖啡因，得到准确的检测结果。
1 材料与方法
1.1 试验材料
云南小粒咖啡豆（市售）；超纯水；氧化镁（MgO）；甲醇（CH3OH）：色谱纯；咖啡因标准品（C8H10N4O2）：纯度≥99%；编号：58-08-2；批号：200911；生产厂家：美国。
高效液相色谱仪（带紫外检测器，Agilent 1260美国安捷伦科技有限公司）；水浴锅（HH-6常州国华有限公司）；电子天平（CP213美国，奥豪斯），感量为0.1 mg；超纯水器（明澈UV24美国密理博公司）。
1.2 试验方法
称取1 g（精确至0.001 g）经粉碎低于30目的均匀样品于250 mL锥形瓶中，加入约200 mL水，沸水浴30 min，不时振摇，取出流水冷却1 min，加入5 g氧化镁，振摇，再放入沸水浴20 min，取出锥形瓶，冷却至室温，转移至250 mL容量瓶中，加水定容至刻度（使样品溶液中咖啡因含量在标准曲线范围内），摇匀，静置，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。
1.2.1 标准曲线的绘制
咖啡因标准储备液（2.0 mg/mL）：准确称取咖啡因标准品0.002008 g（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。放置于4 ℃冰箱，有效期为6个月。
咖啡因标准中间液（200 μg/mL）：准确吸取5.0 mL咖啡因标准储备液于50 mL容量瓶中，用水定容。放置于4 ℃冰箱，有效期为一个月。咖啡因校准曲线工作液：吸取咖啡因标准中间液，配制成浓度分别为10.0、20.0、40.0、80.0、100、120.0、160.0、200 μg/mL的工作液，临用时配制。将标准系列工作液经液相色谱仪测定，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.2 仪器工作条件
色谱柱：C18柱（粒径：5 μm，3.9 mm×150 mm）；流动相：甲醇+水（24+76）；流速：1.0 mL/min；紫外检测器：检测器波长272 nm；柱温：25 ℃；进样量10 μL。
2 结果与分析
2.1 校准曲线
取咖啡因标准溶液，用高效液相色谱仪自动进样，标准曲线方程为y=27.32252x+12.55479，r=0.99985（见表1），表明线性关系良好。
2.2 精密度试验
取咖啡因含量高、中、低3个浓度分别进行6次测定，计算6次结果的相对标准偏差，变异系数均小于15%（见表2），表明使用该方法测定咖啡因数据可靠。
2.3 检出限
方法的测定限为信噪比（S/N）3∶1时的浓度，计算得到方法检出限为：0.000 5 μg/mL，即：0.125 mg/kg。
定量限为信噪比（S/N）10∶1时的浓度为：0.42 mg/kg。标样色谱图如图1，样品色谱图。
2.4 回收率和误差
精确称取1.0 g云南小粒咖啡豆样品，加入标样，浓度为20.28 μg/mL，进行3次测定，经测定后平均值117.634 4 mg/kg，误差为3.6，回收率为97%（见表3）。偏差范围小，说明该方法的准确度较好。
3 结语
试验结果表明，采用建立的高效液相色谱检测方法测定云南小粒咖啡豆中的咖啡因，具有准确、快速、简便的优点，且测量的范围满足标准限量的检测要求。
参考文献
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